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1、计算机学报2009年12期，2009，32（12）DNA计算中荧光技术的应用及其发展张成 杨静 王淑栋 (北京大学信息科学技术学院，高可信度软件技术教育部重点实验室，北京 100871)摘要：DNA计算作为前沿科学研究的重点和热点，已经从简单发展为复杂，从理论转化为应用。在这一过程中，反应速度快，变化灵敏的荧光标记技术发挥了重要的作用。本文围绕DNA计算和荧光标记技术两个方面进行说明。一方面，对近年来DNA计算中荧光技术的应用进行了总结：（1）荧光标记的表面计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术。（4）与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门。（5）与D
2、NA自组装立体结构相结合的荧光技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术。另一方面，介绍了几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。在今后的研究中，只有将这两者紧密结合，才能发挥DNA计算天然的优势。关键词：DNA计算；荧光标记技术；纳米技术；DNA分子；杂交 1 引言DNA由于其具有的特性，在大自然的进化中，被选择为稳定的遗传物质。在细胞中，DNA精细地编码并控制着整个细胞的新陈代谢。另一方面，DNA分子容易构成二级甚至三级结构。因此，DNA作为计算工具有着
3、得天独厚的优势1,2。近年来，DNA计算领域发展迅速，尤其在DNA分子自组装、DNA纳米装置等方面3。然而伴随着DNA计算解决问题的规模增大和形式多样化，求解过程中DNA分子数量急剧增加以及DNA分子结构复杂性的加大，求解过程中实验过程繁琐且存在误差，使得DNA计算中解的标记和检测变得更加困难4。为了解决这一难题，荧光技术在DNA计算中逐渐得到了广泛的应用。荧光是指某些物质受到某种波长的光激发后，其原子中的电子被激发到较高能级，产生的发射光。荧光物质分子都具有刚性结构和共平面的-共轭体系。在激发态时，这种结构具有稳定性，可以持续数秒钟，从而有利于能量的转移5。DNA荧光技术在生物学领域中已经有
4、很多应用，如近年来发展起来的DNA荧光标记、real-time检测技术、分子信标技术等。荧光标记DNA简单便捷，可以实时检测，而且灵敏度非常高，这些特点都使得其在DNA计算中具有广泛的应用前景。目前，结合荧光技术的DNA计算已经成为前沿研究热点。荧光技术在DNA计算中的应用主要有如下几类：（1）荧光标记的表面计算：通过DNA固定化和杂交技术，在固相表面通过荧光标记进行计算。（2）与某些酶切技术相结合的荧光检测：利用特定酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。（3）与DNA链置换相结合的荧光技术：巧妙利用DNA分子的三链甚至多链结构，通过加入引发链，来释放另一DNA链。（4）与基因沉
5、默技术相结合的荧光DNA逻辑门：利用RNAi技术控制表达荧光蛋白，从而构建了多重逻辑门。（5）与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术：在DNA自组装结构的基础上，结合了荧光标记技术。（6）与DNA变构相结合的荧光技术：通过DNA分子的不同状态，构建了可控的荧光纳米装置。近年来，荧光技术不仅应用于生物学本身，而且在DNA计算、信息学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面有几种近年来发展起来的新型荧光技术：（1）荧光信号识别放大技术。（2）与磁珠技术相结合的荧光技术。（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术。（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。相信随着DNA计算和荧光技术的发展，这两者必将紧密结
6、合，使得DNA计算的种类和方法更加多样和成熟。2 DNA计算中荧光技术的应用2.1荧光标记的表面计算DNA表面计算其基本原理是：通过DNA固定化和杂交技术，将代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通过多次的杂交以及降解过程来筛选正解。通过荧光标记可以检测每次和最终计算的结果。2002年，Adleman组使用杂交池完成了一个20个变量的3可满足性问题6。2004年XingPing Su等在2000年Liu7的工作基础上，设计了一种通用型的DNA表面计算模型8。同年，Kristiane A. Schmidt等利用单分子杂交荧光标记技术4个变量的可满足性问题9。下面以2000年，Li
7、u 等发表在nature上的DNA表面计算经典实验为例，说明其解决SAT问题的过程7。由于该问题共有16种可能性，故将代表着不同可能解的DNA片段固定在固相表面。在每一次的杂交筛选过程中，加入与固定DNA链特异性互补的DNA。那末，被杂交的固定DNA链变为双链，而未互补的单链DNA则被核酸外切酶降解。通过数次操作，存在于固相表面的DNA链就是每次经杂交而保留下来的DNA链，也就是代表正解的DNA链。该实验中，荧光技术主要应用在解检测的过程中：使用一条生物素标记的引物和另一条荧光标记的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段为模版，进行PCR。利用磁珠将PCR双链产物吸附，再分离双链，分离出荧光标
8、记的ssDNA。将这些ssDNA与经过多次杂交筛选的固相杂交，只有哪些存留在固相表面的DNA链可以杂交上，于是特定的位置就可以检测到较高荧光强度。 图1-1 实验示意图 图1-2 列阵荧光检测结果2.2 与某些酶切技术相结合的荧光检测利用酶与DNA分子的特性，通过检测酶切后荧光量进行计算。其实就是利用某些酶与DNA分子空间结构的相互作用，再结合荧光技术来共同实现的。这种方法具有灵敏度高，反应速度快等特点。其最大的优点就是巧妙地将酶的生物特性与计算问题相结合，极大地丰富了DNA计算的手段。2001年，Wang等在上述表面计算实验的基础上对解的检测又进行了新的改进，即将酶切和荧光技术相结合10。通
9、过上述核酸外切酶的方法，利用新技术完成单链DNA的解的检测。其基本思想如下：左侧DNA探针的3端至少和右侧杂交的DNA探针有一个碱基的重合，并使得右侧探针有5端呈单链状态。此时右侧探针由两部分组成：一部分是和目标序列形成双链的；另一部分则是由非互补的5端DNA链组成（见图2A）。此时该非互补的5端DNA臂会覆盖在上游寡核苷酸链上，与左侧探针至少有一个重合的碱基。恰恰在这重合的位置，可以形成酶切位点。因此，非互补的5端DNA臂可以被切割而释放。利用这一原理，结合荧光技术，如图所示，将荧光基标记在非互补DNA链的5端，而将荧光淬灭基标记在重合的酶切位点3端方向（见图2B）。这样，只要酶切位点被酶切
10、，标记有荧光基的非互补的5端DNA链就会被释放，从而与荧光淬灭基分离，使得荧光释放量大大提高。这种方法可以有效检测目的片断是否存在。文中还将PCR方法检测目的片断与这种荧光检测法进行了对比，发现该方法比PCR检测具有更高的灵敏度。图2 实验原理示意图 图3 几种逻辑门的构成示意图Milan N.等2003年研制了一种名为MAYA的游戏。这是一种利用特殊的DNA酶E6（一种依赖于DNA的RNA酶）构建起来的逻辑门11。这种酶识别的DNA底物要求具有特殊结构（如3a图所示）。只有当上部寡核苷酸探针与E6的支架区互补，上部寡核苷酸才能被切断释放。将寡核苷酸两端分别标记荧光淬灭基（如罗丹明）和荧光基，
11、那末只有寡核苷酸探针被切断释放，荧光基才能有效激活并释放荧光。这是MAYA游戏进行逻辑判断的主要检测手段。构建有效的空间位阻是实现这个检测手段的关键。当寡核苷酸探针的结合使绿色标记的位阻消失的时候，加速酶切反应；当寡核苷酸探针的结合使红色标记的位阻消失的时候，降低酶切反应。基于以上原理，构建出以下几种逻辑门：YES型、NOT型、AND型和AND-AND-NOT型。YES型逻辑门（图3b所示），当i1寡核苷酸加入时，消除原来i1环状结构，从而标记的荧光探针可以与之结合，并且被切除释放。其判断过称为加入i1，荧光输出。NOT型逻辑门（图c所示）。当加入i6时，环状结构打开，荧光结合的寡核苷酸探针无
12、法结合在互补区域，于是无荧光输出。其判断过程为加入i6，荧光输出停止。AND型逻辑门（图d所示）实际上是将两个YES型逻辑门组装在一起。也就是说，只有当i1和i6都被加入时，才能有荧光输出。AND-AND-NOT型逻辑门（图e）是更为复杂的组合体。必须同时加入i1和i3，才能输出荧光。然而，只要有i6存在，就不会输出荧光。文中解决的问题是在33的棋盘中完成3个棋子同线相连。考察所有的逻辑情况后，将所有可能的逻辑门都提前置于棋盘的网格中。再将代表棋子的寡核苷酸分别放入，然后观察荧光输出情况进行判断。2.3 与DNA链置换相结合的荧光技术该技术多用来构建DNA逻辑门。其巧妙利用DNA分子的粘贴，通
13、过加入引发链，来释放另一DNA链。在逻辑计算中，这种技术具有循环性、自引发性、反馈性、灵敏性和准确性等特点。近年来在science等高水平科研杂志上都发表了大量系列工作，而且在生物检测领域具有广泛的实际应用前景。2000年，Bernard Yurke构建了一种DNA链置换机器，在置换过程中可以实现闭合式运动12。2003年，B. Yurke等构建了一种基于DNA链置换的纳米机器13。Jong-Shik Shin等利用可反复的DNA链置换，构建了可以反复读取和输入的三状态存储器14。2006年，Georg Seelig等对DNA链相互粘贴、置换的几种模式进行了实验15。2006年，Simon J
14、. Green等用茎环结构实现了DNA链的粘贴互换16。2007年，David Yu Zhang等实现了DNA链置换的循环进行17。2007年,suvir venkataraman等实现了通过DNA链自粘贴来完成多段DNA聚合延伸18。下面介绍两个具有代表性的工作。2006年，Georg seelig 等报道了一种没有酶参与的DNA逻辑门19。其基本原理如图4-1所示，即先构建好由寡核苷酸链G、Eout、F共同杂交组成的DNA互补结构，再加入Gin寡核苷酸链。此时，由于Gin一侧末端和G的一侧单链末端互补，从而使逻辑门中的G寡核苷酸链被释放，与Gin形成互补双链。此时的互补结构中，只剩下了寡核
15、苷酸链Eout和F。然后再加入Fin寡核苷酸链，Fin的一侧末端与F中间有互补序列，加之Eout本身形成的是单链环状的不稳定结构，于是，F和Fin结合成双链。Eout寡核苷酸链被释放。文中使用了荧光标记地对Eout的释放情况进行了检测（如图4-2所示）。Eq末端标记有荧光基，而Ff末端标记有荧光淬灭基。当其互补结构存在时，荧光恰被淬灭，从而无法检测。但是，当Eq和Ff分离时，荧光就被释放出来，从而表明DNA链的分离情况。上述由G、Eout、F的DNA互补结构就可以构成与门。也就是说，只有同时加入Gin和Fin，才能诱发释放出荧光。值得注意的是，文章并不只是提出这种DNA计算逻辑门，而是将其应用
16、到生物基因检测的中。在鼠脑总RNA中，成功的检测了数个基因的表达情况。图4-1链置换原理示意图 图4-2荧光标记原理示意图2008年，Peng Yin等对这种DNA自粘贴、链置换进行了更为精细的研究20。其主要原理是利用DNA茎环结构的链置换。如图5-1所示，茎环结构A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列构成的，在茎环结构末端有未互补的单链DNA区域。如果加入与末端单链DNA互补的序列，整个茎环结构就会打开（图中的at与at*可以互补，其它同理）。因此，当体系中只加入A、B这两种茎环结构时，相互之间无任何影响。但是，当体系中加入了寡核苷酸链I后，就触发了整个循环。I先和A末端互补，使得
17、A的茎环结构打开。此时，A的Bt区域与B的Bt*相互作用，使得B的茎环打开。当B完全打开后，B的a*区域会与I竞争A的a区域形成互补结构。被置换掉的I就可以重新激发新的循环。 在上述基础之上，Peng Yin等设计了多种复杂结构的实验：直线型、回路型、支架型、自动位移型（见图5-2）。直线型指I与A、B、C组件是逐级触发，形成串联关系。回路型指参与的激发物在循环结束后又被释放，从而再次作用于系统。并且构建了多个循环相互镶嵌的复杂体系。支架型指在整个触发过程中，不仅是线性的作用方向，而且是向二维平面的扩展。自动位异型则是用链置换实现了特定DNA序列的位移。在这些实验中，荧光技术发挥了重要的作用。
18、其中主要是将荧光基标记在茎环的一端，另一端则标记有荧光淬灭基。只有茎环结构打开，才能够检测到相应的荧光。根据标记不同的荧光，可以了解整个循环的反应速度，和反应程度。尤其是在自动位移型实验中，通过检测荧光，可以得知特定DNA序列在特定时间移动的位置。图5-1 茎环结构DNA置换原理 回路型直线型自动位移型 支架型图5-2 几种复杂类型：直线型、回路型、支架型、自动位移型2.4 与基因沉默技术相结合的荧光DNA逻辑门2007年，keller等创造性地使用活体细胞，利用RNAi技术，通过控制特异基因的表达，构建多重逻辑门。这种技术将DNA计算和基因表达、疾病诊疗有机的结合在一起，为DNA计算的应用指
19、出了另一方向21。RNAi技术是近年来发展起来的特异性沉默基因技术，其基本原理就是将想敲除的基因序列或者部分序列构建到特定载体中，经过转录，形成部分序列的反义RNA（还可以通过直接加入特异的反义短寡核苷酸进行基因敲除）。这些RNA很快就可以被酶解为小片段，并与相关的蛋白质形成复合体。于是，这种复合体就可以根据RNA来识别特定的mRNA，从转录水平消除特定基因。keller等利用载体序列的线形串联排列以及基因表达的调控原理（非翻译区UTR对下游基因转录的影响），构建了多个逻辑门模型。（1）或门，如图6-1a所示，mRNA1和mRNA2分别与荧光蛋白基因串联。这两个mRNA只要有一个正常转录表达，
20、就会有荧光蛋白输出。因此，形成了“或”的关系。（2）与门，如图6-1b所示，Target A、Target B序列是串联分布。假设有A、B两种内源物分别抑制siRNA-A和siRNA-B对TargetA、B的影响。那末只有同时加入A、B时，才能完全抑制RNAi作用，也就是说，此时荧光蛋白才能正常表达。因此A和B形成“与”的关系。（3）非门，如图6-1c所示，假设内源物A对siRNA-NOT（A）有激活作用。当加入A后，将会抑制Target-NOT（A）的表达，此时直接导致荧光蛋白产物的减少。将这些简单的逻辑门组合起来，就可以实现复杂的逻辑运算，如（A AND C AND E） OR（NOT（A
21、） AND B），见图6-1d。首先确定A、B、C、E与各个siRNA之间的关系，如：加入A抑制siRNA-A，促进siRNA-NOT（A）。当A、B、C、E共同作用时，就可以根据基因排列的线性关系自动进行逻辑判断。图6-1 RNAi逻辑门示意图 在上述一步完成的RNAi逻辑门的基础上，还构建了二层逻辑门。所谓一步完成是指加入的siRNA直接发生作用，降低荧光基因的表达。而二层逻辑门是指首先调控一级蛋白质产物，再由一级蛋白质来调控二级荧光蛋白基因的表达。如图a所示，构建了AND运算逻辑门。mRNA1和mRNA2的表达都下降才能最大限度地减少Lac抑制子的表达，从而减小Lac抑制子对荧光蛋白的表
22、达抑制。这种多层逻辑门与细胞内的蛋白、基因调控极为相似，因此在疾病诊疗方面有着广阔的应用前景。图6-2 二层逻辑门示意图2.5 与DNA自组装立体结构相结合的荧光技术DNA自组装是近期发展迅速的领域，也是具有应用前景的领域。其涉及编码、杂交、空间结构设计等多个方面。从自组装结构上分，自组装可分为一维线段结构、二维平面结构和三维立体结构。在DNA自组装结构的基础上，结合荧光标记技术，发展了很多精巧的DNA三维结构，如2008年Russell P Goodman等构建的四面体，其边还可以产生荧光标记的可伸缩茎环22。这些三维结构不仅仅包含有图像、结构信息，而且还能随着结构的变化应用于纳米技术、药物
23、载体、DNA计算等方面。2008年Yossi Weizmann等的工作是将DNA自组装和荧光技术紧密结合的一个例子23。首先，利用DNA分子互补，将两环相接触部分的DNA序列设计为互补，杂交后再经连接酶连接，就形成了稳定的环链结构。通过AFM电镜检测，也能够看到环链结构的存在。另外，将一个环状寡核苷酸固定在有金包被的AFM电镜感应头上，而与其有互补序列的寡核苷酸则被固定在镀有金的玻璃板上。当杂交并且被连接后，其感应力较未被连接有了显著提高，侧面说明环套结构的存在。在此基础上，还设计了将DNA环分别固定在两个金微粒（1.4nm）上，然后利用内切酶进行切割分离的实验。实验结果证明，这些操作都可以在
24、环套结构上成功实现。除了上述电镜检测外，Yossi Weizmann等还利用荧光技术进行了一系列实验。首先，如图A所示，将四甲基罗丹明标记在短寡核苷酸上，通过杂交，形成环套和多个短寡核苷酸复合物。在电镜下，可以观察到柱状荧光条带。然后，使用四甲基罗丹明标记的凝血酶，当凝血酶结合在环套的侧面时，利用AFM电镜就可以观察到荧光条状DNA，并伴有多节膨大结构。同时，还对环套结构进行了类似的双荧光探针杂交，结果发现产生了荧光共振能量转移。因为只有当两个荧光基和淬灭基的距离小于5nm时，才会出现能量转移，因此，也说明环套结构是有序排列存在的。图7-1 环链结构组成 图7-2荧光段寡核苷酸和凝血酶标记的环
25、链 图7-3 DNA盒子盖开闭示意图2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地将DNA荧光技术应用在检测纳米装置开启和闭合24。为了检测DNA分子纳米盒子的盖子的开闭，分别在盖子和盒体上标记了Cy3和Cy5荧光染料（见图7-3）。当加入“钥匙”DNA链时，盒子盖打开，两个荧光分子分开。此时，Cy3的荧光信号增加，而Cy5荧光信号下降。在该实验中，利用荧光信号增减可以有效地检测DNA纳米装置的空间变化。2.6 与DNA变构相结合的荧光技术通过DNA分子的不同状态，构建可控的荧光纳米装置。随着DNA分子的变构，其荧光强度也随之变化。因此，通过检测荧光强度就可以知道DNA分子的构象变化。19
26、99年，Mao等构建了一种基于DNA分子变构的纳米装置25。其应用的原理就是B、Z型DNA的相互转换。B-DNA就是我们所熟悉的右手螺旋结构。但是，对于含有多个GC的重复序列，当离子浓度发生变化时，就会伸展为左旋结构。如图8-1所示的DNA复合结构是由三条链组成的。其中，蓝色的两条链相同。在每个连接的转折处都由4的相连的T组成。在这个复合结构的中部，也就是黄色标记的序列，其中含有多个GC的重复序列。当改变离子浓度时，该区域就会伸展成为左旋结构。将荧光发射基和接收基固定在如下所示位置（圆点）。那末只有当复合结构是B-DNA时，才能通过能量转移激发出荧光。当其为Z-DNA时，由于两个基团距离加大，
27、从而无法实现能量转移。图8-2为B、Z型DNA转换时其能量转移的变化。图8-1 DNA复合结构变构示意图 图8-2 DNA转换时其能量转移3 近期荧光技术的新发展荧光技术发展速度很快，在DNA计算、信息学、物理学等诸多领域具有很大的应用潜力。下面介绍几种近年来发展起来的新型荧光技术，希望能为DNA计算提供新的思路。（1）荧光分子信标信号放大技术；（2）与磁珠技术相结合的荧光技术（3）与PH值变化相结合的DNA荧光技术；（4）与miRNAs检测相结合的荧光技术。3.1荧光分子信标信号放大技术分子信标技术是目前较为成熟的技术，尤其是在检测方面有着重要的应用。但是当检测物很少时，分子信标产生的荧光就
28、不足以被检测，甚至发生错误信号。2008年，Gary K Geiss等报道了一种基因表达的多色荧光分析系统26。其中使用了固定化、探针捕捉、多色荧光标记等多种技术。2005年，Ernest K. Lewis等设计了能同时激发多种荧光的方法，使得DNA检测速度以及准确度都大大提高27。2008，Jianwei Jeffery Li等提高了荧光分子信标的信号强度28。其原理（如图9-1所示）就是先通过普通的分子信标杂交过程，待分子杂交产生荧光信号后，此时，加入特异的缺刻DNA酶，即将因杂交而展开的分子信标切断，并释放。从而，再进行新的一轮分子信标杂交释放。那末荧光信号就会积累增多。在此基础上，还建
29、立了一种加强型荧光分子信标信号放大技术（如图9-2所示）。首先，与目标片断互补的单链DNA杂交，再使用连接酶进行连接成环。随后，利用DNA聚合酶29以环状DNA为模板，加入单引物进行PCR。在随后扩增的线性模板上，就含有多处目标片断。此时，再进行上述的荧光分子信标信号放大。就可以大大提高信号强度。图9-1 荧光信号积累原理 图9-2 加强型荧光分子信标信号放大原理3.2与磁珠技术相结合的DNA检测荧光技术磁珠技术，使得DNA分子的捕捉和释放变为可能。通过DNA特异性杂交，可以特异性的获取DNA分子。2005年，Hui Xu等就将磁珠技术与荧光技术相结合，建立新型的DNA检测系统29。首先，将标
30、记生物素的DNA1与磁珠相结合。通过目标DNA3，可以使DNA1、2、3相互杂交，形成复合体。在DNA3上标记有荧光集团。通过磁珠分离，将捕获的DNA2和目标DNA3洗脱。由于DNA分子本省带有负电荷，于是可以与带有正电荷的水溶性聚乙烯（被标记有特殊基团）吸附。此时就会产生能量转移，从而产生荧光，并被检测（如图10所示）。图10与磁珠技术相结合的DNA检测荧光技术原理3.3与PH值变化相结合的DNA荧光技术DNA的构象会随着PH值的变化而改变。利用这一特性，2005年，DongSheng Liu等构建了一种随PH值变化的DNA荧光装置30。整个装置是由DNA寡核苷酸阵列构成的。在每个寡核苷酸的
31、5端标记有-SH，随后是由-CCCC-4个胞嘧啶组成的DNA序列，在3端标记有若丹明绿色荧光基团。每个DNA寡核苷酸被固定在金表面。当PH值较低时（4-9之间），有些胞嘧啶会发生质子化，从而与其他胞嘧啶产生分子间非经典配对。此时，寡核苷酸链就会形成蜷缩状结构，而不会与互补链杂交（如图11-1所示）。在这种状态下，荧光集团非常靠近金表面（约1nm），此时就不能被激发光激发。随着PH值的增大，胞嘧啶质子化程度降低，其分子间非经典配对也随之降低。若加入互补链，在金表面，展开的寡核苷酸会与互补链杂交，使得寡核苷酸3端的荧光集团远离金表面（约8nm）。当有激发光激发时，就会产生绿色荧光，实验还证实这种荧
32、光的变化是可逆的。通过控制PH值，可以有效地进行荧光变化。图11-1 原理图图11-2 随着PH值荧光可逆地进行变化。a：PH值4.5；b：PH值9.0；：PH值4.5；：PH值4.5；3.4 与miRNAs检测相结合的荧光技术 miRNAs在真核生物的调控中发挥着重要的作用。但是miRNAs的含量很低，检测起来比较困难。结合DNA寡核苷酸微列阵技术、荧光技术、酶切、酶联技术，2004年Peter T Nelson等发明了一种称为RAKE的检测miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列阵。每个寡核苷酸由三部分组成：支架序列、数个胸腺嘧啶、特异性miRNAs的互补序列。将寡核苷酸链5端共价连在
33、芯片玻璃表面。其次，当miRNAs特异性杂交在寡核苷酸上时，用核酸外切酶处理，将没有特异性杂交上miRNAs的寡核苷酸链降解。此时保留下来的寡核苷酸上都杂交有miRNAs。与此同时，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs为引物，以保留下来的寡核苷酸链为模板，再加入共价连接有生物素的dATP进行扩增。最后，加入共价连接有荧光基团的链合霉素，使其与连接有生物素的DNA链结合。通过激发荧光，保留下来的、并被扩增了的寡核苷酸区域就会发出荧光。其荧光量的多少，还能显示该miRNAs量的多少。图12 RAKE原理示意图4 展望在生物技术高速发展的今天，DNA计算的研究也是日新月异。近年来，在高水平科
34、学研究刊物上，发表了大量DNA计算方面的研究成果。DNA计算一直是世界科研领域的研究重点和热点。DNA计算发展至今，已经从开始的实验阶段逐渐转入实用阶段；从单一型技术逐渐发展为多元化技术；从简单的结构逐渐扩增为复杂结构。荧光技术作为一种生物技术，其发展较早，且应用广泛。因其体积小，便于标记，反应速度快，变化灵敏，所以在核酸标记和检测方面有着得天独厚的优势。对于DNA计算这种精细化、定量化、复杂化的发展，荧光技术的种种特性都可以满足并适用于DNA计算的发展。比如近两年，关于DNA链置换荧光技术的研究，这种链置换过程都属于单分子间的变化，如果使用常规生物实验手段根本无法实现。而荧光技术的单个分子标
35、记，荧光激发和湮灭性质，及其实时超高灵敏性检测都表明其在DNA计算中的天然优势。因此，荧光技术的进步必然推动DNA计算的发展。同时，荧光技术在DNA计算的应用也拓宽了其自身应用领域。这种跨学科、跨领域的融合贯通是推动整个科学前进的原动力。一方面，应该关注荧光技术与其他生物技术（如基因芯片技术、磁珠技术等）最新的发展和联系；另一方面，必须深刻的认识和了解计算科学所亟需解决的重要问题。只有充分的将两个方面有机地结合，通过提出创造性想法，才能将DNA计算转变为实用、稳定的计算手段；才能发挥DNA计算天然的优势.参考文献1. 许进等.DNA计算机原理、进展及难点()分子生物计算中的数据结构与特性.计算
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