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1、第七章 克隆基因的表达及基因干扰,上海交通大学 倪培华,第七章 克隆基因的表达及基因干扰,第一节 外源基因的表达,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,第三节 基因表达干扰技术,第一节 外源基因的表达,第一节 外源基因的表达,二、真核生物表达体系,一、原核生物表达体系,一、原核生物表达体系,（二）原核表达载体具有的特点,（四）包涵体,（一）对外源目的基因的要求,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,一、原核生物表达体系,（一）对外源目的基因的要求 不应具有5端非编码区以及内含子结构,选择标志 启动子 翻译起始点和终止序列 多克隆位点,（二）原核表达载体具有的特点,一、原核生物表达体系,一、原核生
2、物表达体系,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,1.非融合型表达蛋白,2.融合型表达蛋白,3.分泌型表达蛋白,1.非融合型表达蛋白 优点：表达的非融合蛋白与天然状态下存在 的蛋白在结构、功能以及免疫原性等 方面基本一致 缺点：易被细菌蛋白酶破坏,（三）真核生物基因在原核细胞中的表达,一、原核生物表达体系,常用的非融合型表达蛋白表达原核载体pKK223-3抗氨苄青霉素基因 Tac启动子 SD序列 AUG起始密码转录终止序列T1和T2,一、原核生物表达体系,一、原核生物表达体系,2.融合型表达蛋白 优点：融合蛋白具有抗原性可以作为抗原，可以抵御细菌蛋白酶的破坏,一、原核生物表达体系,融合型表达系
3、统主要有His系统GST系统金黄色葡萄球菌蛋白A系统-半乳糖苷酶系统麦芽糖结合蛋白系统,一、原核生物表达体系,3.分泌型表达蛋白 可防止大肠杆菌对表达产物的降解，而且能够减轻大肠杆菌代谢负荷和易于恢复表达产物天然构象,（四）包涵体,1.包涵体的形成 2.包涵体的分离与纯化 3.包涵体的复性,一、原核生物表达体系,二、真核生物表达体系,（一）酵母表达体系,（二）哺乳动物细胞表达体系,二、真核生物表达体系,（一）酵母表达体系,1.酵母表达载体,2.酵母表达外源性基因的形式,二、真核生物表达体系,（一）酵母表达体系 1、酵母表达载体 选择性标志 复制子 启动子上游活性序列 终止序列 蛋白结构域,二、
4、真核生物表达体系,2.酵母表达外源性基因的形式 非分泌型 分泌型,二、真核生物表达体系,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,3.哺乳动物细胞的瞬时表达和稳定表达系统,（二）哺乳动物细胞表达体系,1.哺乳动物细胞表达载体(1)原核DNA序列(2)启动子(3)增强子(4)剪接信号(5)遗传标记(6)终止信号和多聚腺苷化的信号,二、真核生物表达体系,二、真核生物表达体系,2.常用的外源基因转染哺乳动物细胞的方式,3.哺乳动物细胞的瞬时表达 和稳定表达系统（1）COS细胞瞬时表达系统（2）CHO细胞稳定表达系统,二、真核生物表达体系,第二节
5、表达产物的分离、纯化与鉴定,第二节 表达产物的分离、纯化与鉴定,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,三、表达产物的鉴定,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化,1.粗制品的分离纯化 2.精制品的分离纯化,二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化,1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化 2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化,三、表达产物的鉴定,1.蛋白质样品的制备 2.SDS聚丙烯耽胺凝胶电泳 3.蛋白质的电转移,四、表达产物的鉴定,4.靶蛋白的免疫学检测封闭 靶蛋白与第一抗体反应 与第二抗体反应 显色,四、表达产物的鉴定,四、表达产物的鉴定,第三节 基因表达干扰技
6、术,第三节 基因表达干扰技术,二、核酶与脱氧核酶,三、小干扰RNA,四、微RNA,一、反义核酸技术,一、反义核酸技术,（二）反义RNA技术,（三）反义核酸技术的应用,（一）反义寡核苷酸技术,一、反义核酸技术,（一）反义寡核苷酸技术,1.反义寡核苷酸的作用机制,2.反义寡核苷酸的设计与合成,3.反义寡核苷酸的修饰,4.反义寡核苷酸的给药途径,一、反义核酸技术,（一）反义寡核苷酸技术 1.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达,一、反义核酸技术,2、反义寡核苷酸的设计与合成 1）设计 计算机软件预测RNA的二级结构 利用寡核苷酸随机
7、文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计,一、反义核酸技术,2）合成 长度一般为1525个核苷酸 G-C含量为60%65%,一、反义核酸技术,3.反义寡核苷酸的修饰 最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰（1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子（2）甲基修饰磷酸骨架（3）聚酰胺键代替磷酸骨架,一、反义核酸技术,4.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌 肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径,一、反义核酸技术,（二）反义RNA
8、技术,1.反义RNA的作用机制,2.反义RNA的设计,（二）反义RNA技术,1.反义RNA的作用机制(1)抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解,一、反义核酸技术,一、反义核酸技术,2.反义RNA的设计 与ASON相比，反义RNA的设计较为简单,（三）反义核酸技术的应用,需要完善或解决的问题：防止被核酸酶降解 需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制 很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合 ASON是否会影响正常细胞的基因表达 用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题,一、反义核酸技
9、术,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶,（二）脱氧核酶,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶,1.核酶的分类,2.核酶的结构,3.核酶的设计与修饰 4.核酶转移方法5.核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,（一）核酶 1.核酶的分类（1）大分子核酶：第类内含子、第类内含子、核糖核酸酶P（2）小分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和 neurospora Varkud satellite核酶,2.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个 螺旋环结构区和 一个催化中心,二、核酶与脱氧核酶,（2）发夹形核酶：每个结构域由 螺旋-环-螺旋组成,二、核酶与脱氧核酶,二、核酶与脱氧核酶,（二）脱氧核酶
10、,1.脱氧核酶的结构种类及特征,2.脱氧核酶的催化特性,3.设计合成脱氧核酶的原则,4.脱氧核酶的应用,二、核酶与脱氧核酶,（二）脱氧核酶 1.脱氧核酶的结构种类及特征（1）10-23型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,（2）8-17型脱氧核酶：,二、核酶与脱氧核酶,2.脱氧核酶的催化特性（1）RNA切割活性（2）DNA连接酶活性（3）卟啉金属化酶和过氧化酶活性（4）DNA切割活性（5）N-糖基化酶活性（6）DNA激酶活性（7）DNA戴帽活性,二、核酶与脱氧核酶,3.设计合成脱氧核酶的原则（1）总核苷酸数不超过50（2）催化效率不低于核酶（3）具有广泛的RNA切割功能（4）能通过碱基配对与底物结
11、合（5）具有可重复性,4.脱氧核酶的应用 为治疗RNA病毒感染的疾病提供了一条新途径,二、核酶与脱氧核酶,三、小干扰RNA,（二）RNAi的作用机制,（三）siRNA的设计原则,（四）siRNA的制备方法,（六）RNAi沉默效果的检测,（一）一般研究路线,（七）RNAi的应用,（五）siRNA的导入,（一）一般研究路线,三、小干扰RNA,三、小干扰RNA,（二）RNAi的作用机制 1.起始阶段 2.效应阶段 3.倍增阶段,三、小干扰RNA,三、小干扰RNA,三、小干扰RNA,（三）siRNA的设计原则 1.siRNA中G+C碱基含量 2.siRNA作用位点 3.siRNA序列 4.siRNA碱
12、基数 5.环碱基数 6.对照系统,三、小干扰RNA,（四）siRNA的制备方法 1.化学合成法 2.体外转录法 3.RNase 消化法 4.siRNA表达载体法 5.siRNA表达框架法,三、小干扰RNA,三、小干扰RNA,siRNA的合成方式及特点,三、小干扰RNA,三、小干扰RNA,（五）siRNA的导入 1.脂质体或电穿孔 2.病毒携带 3.细胞穿透肽（六）RNAi沉默效果的检测（七）RNAi的应用,四、微RNA,（二）miRNA的作用机制,（三）siRNA与microRNA的区别,（四）miRNA的生物学功能,（一）miRNA的命名,四、微RNA,miR-#（#代表数字）表示miRNAmir-#（#代表数字）表示相应的编码基因,（一）miRNA的命名,四、微RNA,（二）miRNA的作用机制 1.起始阶段 2.成熟阶段 3.功能阶段,四、微RNA,四、微RNA,（三）siRNA与microRNA的区别 共同点 由22个左右的核苷酸组成 是Dicer酶的产物 需Argonate家族蛋白的存在 与RISC形成复合物起干扰、调节作用 可在转录后、翻译水平上干扰靶mRNA,siRNA与microRNA的不同,四、微RNA,四、微RNA,（四）miRNA的生物学功能 miRNA与生物体的阶段性发育密切相关，可以使特异基因在翻译水平被抑制,
