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1、第七、八、九、十章,1,基因组学时代已经到来,1990年人类基因组计划的启动，至2001年公布人类基因组图谱及初步分析结果，基因组学时代已经到来。这无疑是人类生命科学历史上的一个重大里程碑。人类基因组计划的顺利实施，真正成为生命科学领域第一项巨大的科学工程，催生孕育了基因组学的诞生。,2,基因组学成为多学科相互渗透的“大科学”,生物学科、医学、药学、计算机科学、化学、数学、物理学、电子工程学、考古学和地学等基因组学无疑已成为当前和今后相当长的时期内较活跃和影响较大的生物科学前沿学科之一。,3,4,主要内容,第七章 药物基因组学第八章 药物转录组学第九章 药物蛋白质组学 第十章药物代谢组学,5,
2、1. 药物基因组学的诞生和发展（1）诞生 早在20世纪50年代，人们就发现不同的遗传背景会导致药物反应的个体差异（不同个体对同一药物同一剂量的反应存在量与质的差别）。70年代末，杰弗里提出基因组中每100个碱基中就会有1个出现变异。80年代后期，这些差异被引进药物遗传学，并首次阐明了细胞色素P450酶系中的CYP2D6的基因多态性可以导致病人对药物的代谢出呈现快代谢和慢代谢两种不同的方式。,第七章 药物基因组学,6,一. 药物基因组学的介绍,到20世纪末，由于分子生物学的发展、分子遗传学的发展和人类基因组计划的顺利实施，人类基因的多态性不断被发现和证实，人们认识到人体的许多基因都参与药物在体内
3、的过程，药物在体内的反应和代谢也涉及到多个基因的相互作用。基因多态性导致了药物反应的多样性，并在药物遗传学基础上发展起来了药物基因组学，人类开始从基因组水平研究药物反应的个体差异。从而形成了一门以基因多态性为基础研究药物效应的个体间差异及其规律的新兴交叉学科，即药物基因组学。,7,一. 药物基因组学的介绍,药物基因组学（pharmacogenomics）是研究遗传变异与药物反应相互关系的一门学科，是以提高药物的疗效和安全性为目标。是利用人类基因组学研究不同人群（个体）基因组的遗传学差异对药物反应的影响，以促进新药开发和临床个体化用药的学科。药物基因组学是在药物遗传学（遗传药理学）的基础上发展起
4、来的。一句话：研究个体遗传变异对药物应答的影响。,8,药物基因组学不是以发现新基因、探明疾病的发生机制和预见发病风险为目的，而是利用已知的基因组学理论，研究遗传因素对药物反应的影响，或以药物效应和安全性为主要目标，研究药物动力学和药效学差异的基因特征，以及基因变异所致的不同个体对药物的不同反应。从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系。,9,基因组DNA序列多态性,生命的遗传信息存储于DNA 序列之中，基因组DNA 序列的变异是物种遗传多样性的基础。DNA的多态性：在长期的进化和适应环境的过程中在正常群体中，由于各个体DNA分子的某些位点发生突变 ，产生基因序列差异的现象被称为
5、基因（或DNA）多态性。人类基因组中约0.1%差异序列。包含了重要的个体遗传差异信息，造成了人们患病的不同和对药物的不同反应。,10,分子标记的概念,DNA序列差异形成的分子标记可以反映群体中存在的差异个体。广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列和蛋白质。狭义的分子标记概念只是指DNA标记，而这个界定现在被广泛采纳：能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。,11,分子遗传标记的特点,无表型效应不受环境的限制和影响普遍存在于所有生物数量丰富等特殊优势,12,分子标记的种类,DNA 分子标记在过去20 年得
6、到了迅速发展, 主要可分成三个世代，大致可分为三大类。第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，如：限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）；其原理为: 碱基的改变与染色体结构的变化导致生物个体或种群之间DNA 片段酶切位点的变化, 用限制性内切酶切割改变的DNA, 将产生长短、种类、数目不同的限制性片段, 这些片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后就会呈现出不同的带状分布, 而具有差异的DNA片段就可通过Southern杂交检测出来。,13,第二类是以聚合酶链式反应（PCR反应）为核心的分子标记技术，包括： 随机扩
7、增多态性DNA标记（简称RAPD标记）； 简单序列重复标记（SSR标记）或简单序列长度多态性（SSLP标记）； 扩展片段长度多态性标记（AFLP标记）； 序列标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）；,14,第三类是以基因组序列为基础的一些新型的分子标记，如： 单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简称SNP标记）； 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标记）等。,15,定义：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同序列长度
8、里的单个碱基的差别。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（single nucleotid polymorphism SNP）制备第三代遗传连锁图的遗传标记。,单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）,16,单核苷酸多态性（SNPs）的发生频率最高，人类DNA中每300个碱基对就有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带1000万个SNPs。,17,SNP特点,1.最常见的一种2.数量多、分布广3.具有遗传稳定性4.具有二态性5.可以建立单体型区域6.疾病遗传机制的候选改变位点,18,SNP 的分布,在基因组DNA 中,任何碱基均有可能
9、发生变异, 因此SNP 既有可能在基因序列内, 也有可能在基因以外的非编码序列上。位于基因编码区的SNP（cSNP），cSNP又可分为两种: 一种是同义cSNP, 即SN P 所致编码序列的改变并不影响其翻译蛋白质的氨基酸序列, 突变碱基与未突变碱基的含义相同; 另一种是非同义cSNP, 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变, 从而影响蛋白质的功能。5非编码区；3非编码区；其他非编码区（内含子外显子链接区）。,19,检测方法,比较新兴的方法包括：Taqman探针技术、磷酸测序(pyrosequencing)、DNA芯片(DNA chip)分析、变性高效液相色谱(denatur
10、ing high performance liquid chromatography,DHPLC)、能量转移标记的等位特异PCR、基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF)等.,20,国际人类基因组单体型图计划：HapMap计划,单体型：是指位于一条染色体上某一区域的倾向于整体遗传的一组紧密连锁的遗传标记物，称作单体型（haplotype）。对SNP而言，专指位于单条染色体上某一区域的一组相关联的相邻SNPs的等位位点，倾向于以
11、一个整体遗传给后代。,21,标签SNP(htSNP）：一个染色体区域可以有很多SNP位点，但在每一个单体型中总有几个SNP位点对于检测这一单体型是必需的，称为标签SNP.确定单体型只需检测标签SNP即可。,22,“国际人类基因组单体型图计划”（）是继“国际人类基因组计划”之后，人类基因组研究领域的又一重大研究计划。科学家们将在已完成的人类全基因组序列图的基础上，确定人类经世代遗传仍保持完整的单体型图；以及在不同族群中这些单体型的类型与分布。并将这些不同的单体型标上标签。,23,国际人类基因组单体型图计划：HapMap计划,HapMap计划将鉴定来自世界不同地区的四个群体的常见单体型，以及特异识
12、别这些单体型的标签SNPs。2002年10月，中国、美国、英国、日本、加拿大五国代表在美国华盛顿正式启动了这项计划。中国完成10，美国完成31，日本占25，英国占24，加拿大占10。中国负责3号、21号和8号染色体单体型图的绘制。通过单体型图计划将鉴定出20 100 万个标签SNP 位点。,24,2. 药物基因组学的研究方法,目的：通过基因分型的方式指导个体化治疗。核心内容：筛选和鉴定与疾病或药物应答表型相关的遗传标记物。常用方法：关联分析方法。基于候选基因的关联分析和基于全基因组的关联分析,25,3. 药物基因组学的发展,目前，药物基因组学的发展就是将近几年在研究人类基因组与功能基因组中发展
13、的新技术（如高通量扫描、生物芯片、高密度单核苷酸多态性(SNP)、遗传图谱、生物信息学等）新知识，融入到分子医学、药理学、毒理学等诸多领域，并运用这些技术与知识从整个基因组层面系统地去研究不同个体的基因差异与药物疗效的关系，了解具有重要功能意义的和影响药物吸收、转运、代谢、排泄的多态性基因，从而明确药理学作用的分子机制以及各种疾病致病的遗传学机理，最终达到指导临床合理用药、引导市场开发好药的目的。,26,第八章 药物转录组学,第一节 转录组学概述第二节 转录组学在药学中的应用,27,第二节 转录组学概述,一、转录组广义：指在某一生理条件下，一种细胞、组织、器官或生物体所能转录出来的所有RNA的
14、总和。包括mRNA和非编码RNA。狭义：指活细胞所能转录出来的所有mRNA，即从基因组DNA中转录的基因总和，也称为表达谱。,28,转录组是连接基因组遗传信息和生物功能的蛋白质组的必然纽带,也是基因功能及结构研究的基础和出发点。是基因表达第一步的产物，是细胞最重要的组分。转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式之一。,29,转录组与基因组的关系,转录组是基因组表达的产物。不同的是转录组只能是特定时间和空间条件下表达的基因。转录组来自于基因组，量小的多但重要。人基因组有30亿bp，只有不到3万个能基因转录，转录后的mRNA能翻译成蛋白质的只占整个转录组的40%。转录组是高度动态
15、的，转录组数据通常表现出高度的可变性。,30,二、转录组学,一、概念：是基因组学后新兴的一门学科，是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科。简言之，是从RNA尤其是mRNA水平上研究基因表达情况的学科。研究的主要内容是针对不同条件下基因表达方式的表征。,31,转录组学是基因组学的重要分支，也是连接基因结构和功能的一个桥梁和纽带，更是基因调控研究的主要基础和层面。,32,研究方法,基于杂交技术：1.基因芯片技术基于测序的技术：2.基因表达系列分析（SAGE）3.大规模平行信号测序（MPSS）4.RNA测序技术,33,34,是一种以测序为基础,采用数字化分析手段，在转录物水平
16、上分析特定组织或细胞中基因群体表达状态的（基因组表达模式）的技术。通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而比较完整的获得基因组的表达信息。已成为基因表达定量和定性研究的一种有效工具。,2. 基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）。,1999年发明基因表达系列分析技术,35,36,SAGE技术理论上可以检测到一个细胞内所有转录体的表达，而且可以给每一个转录体定量。,37,SAGE技术的理论基础,一个来自转录产物3端特定位置的一个短的寡核苷酸序列(1014bp ) 含有足够信息，能够鉴定一个特异转
17、录本，可以作为区别转录本的标签( tag) ;例如：一个10碱基的序列能有410=1048576种不同的排列组合，因此在理论上每一个10碱基标签就能够代表一种转录本的特征序列。,38,将短的标签通过简单的方法串联在一起,形成大量多联体,对每个克隆到载体的多联体进行测序,得到代表转录本信息的标签序列。并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式输入计算机中进行处理。将标签串联体的测序信息与已知的标签数据库进行比较分析,可确定在特殊条件或生理状态下生物体基因的真实表达模式,并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度。那么，如何获得标签呢？,39,(1) 提取植物mRNA ,以生物素标记的oligo (
18、dT) 为引物将mRNA 反转录成双链cDNA; (2) 锚定酶(Anchoring Enzyme, AE) 酶切。AE是一种具有4bp 识别位点的限制性内切酶,常用Nla ,识别位点为CATG。能使每一种转录本至少被酶切一次,获得mRNA polyA尾部与最近的酶切位点之间的片段；将其作为该转录物的独特信息;,40,(3) 将所得cDNA 等分为两部分,分别与接头1 和接头2 （40 bp）连接：基本结构为引物1/ 2 结合序列+ 标签酶识别位点+ 锚定酶识别位点; (4)标签酶（TE）切割：常用的标签酶如: Bsm F I ,其切割位点距识别位点10-14bp 。产生连有40 bp 接头和
19、914 bp 转录本特异序列的约50 bp 的cDNA标签1、2。,41,标签1,标签2,连接酶连接,双标签(ditag),根据连接子1和2的序列引物进行PCR扩增,锚定酶（AE）切掉接头,连接双标签成收含2050 个标签的多标签串联体，克隆串联体到载体中,得到SAGE 文库、测序。用SAGE 软件分析所得标签数据进行表达频率的分析。,42,将每3050个双标签连接起来，并克隆到载体中，建立SAGE文库；,43,常规SAGE方法 （short SAGE）基本 流程P194,44,SAGE分析软件。SAGEmap是NCBI开发的基于公用SAGE数据库的基因表达谱分析工具。,45,SAGE结果分析
20、,46,SAGE技术的应用,正常细胞或组织基因表达谱研究疾病相关基因表达研究染色体表达图谱绘制基因功能研究药物作用机制的研究毒理学研究 寻找新的基因,47,SAGE实例,48,LongSAGE技术标签来自转录物3端一段21bp的序列，可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与Short SAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（MmeI），并将程 序做了相应修改。,49,第九章 药物蛋白质组学,50,蛋白质组（Proteome）这一概念是由澳大利亚学者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公开发表在1995年7月的Electrophoresis杂志上。
21、其英文PROTEOME是由PROTEins和genOME两个词组合而成，意思是“proteins expressed by a genome” 。,51,蛋白质组指某一基因组、一个细胞、一个有机体或某一特定的组织所表达的全部蛋白质。,蛋白质组学（proteomics）是指研究蛋白质组的科学，实质上采用大规模、高通量、高效率的技术手段研究蛋白质的特征、功能，整体上研究基因组所表达的所有蛋白质在不同时间与空间的表达谱，全景式地揭示生命活动的本质。,52,53,蛋白质组学研究主要涉及的内容：一是表达蛋白质组学，研究差异样品间蛋白质表达量的变化；二是结构蛋白质组学，也称为细胞图谱蛋白质组学，对蛋白结构
22、进行分析，定位，和相互关系。三是功能蛋白质组学，研究执行某种功能的蛋白质复合体，蛋白质间相互作用，蛋白质-DNA/RNA相互作用和翻译后修饰等。,54,新的研究趋势,亚细胞蛋白质组学定量蛋白质组学磷酸化蛋白质组学糖基化蛋白质组学相互作用蛋白质组学此外，药物蛋白质组学,55,其研究的主要支撑技术有双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)、质谱(mass spectrometry，MS)为代表的蛋白质鉴定技术、芯片技术酵母双杂交技术生物信息学。,56,（一） 双向电泳技术,双向电泳（two dimension electrophoresis，
23、2D）是分离混合蛋白质最常用的方法。由OFarrell等于1975年创立 该方法是依赖于蛋白质的等电点的不同和相对分子质量的不同而构建的。,57,双向电泳由两部分构成：等电聚焦（IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳和 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离。是蛋白质组学研究的核心技术之一。,58,59,1、等电聚焦电泳,60,2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,61,双向电泳,62,63,蛋白质被分离以后用考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色或放射性标记等方法显示。其中银染
24、方法非常灵敏，蛋白质分辨率可以达ng级。,64,65,野生型和突变体棉花胚珠总蛋白质样品的双向电泳图谱比较,66,67,68,2-DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率，便于计算机进行图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。,69,（二） 质谱(mass spectrometry，MS),质谱技术是蛋白质组研究中的重要鉴定技术，是一种超灵敏的鉴定技术。,70,进样系统,离子源,质量分析器,检测器,1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱,1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光,1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆,质谱
25、仪需要在高真空下工作：离子源（10-3 10 -5 Pa ） 质量分析器（10 -6 Pa ）,质谱分析原理,71,其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(/值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的/值，分析鉴定未知蛋白质。,72,在磁场存在下，带电离子按曲线轨迹飞行；改变加速电压V, 可以使不同m/e 的离子进入检测器。质谱分辨率 = M / M （分辨率与选定分子质量有关）,质量分析器原理,73,目前常用的质谱包括两种：基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和电喷雾质谱（ESI
26、-MS）。,74,LDI-1700激光解吸飞行时间质谱仪,75,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,MALDI-TOF-MS的基本原理是将微量蛋白质与过量小分子基质分子(主要是有机酸)的混合液体点到样品靶上, 经加热或风干形成共结晶, 然后放入离子源内，用激光(337 nm的氮激光)照射靶点上的晶体时,晶体升华, 导致蛋白质的电离和汽化并进入气相。,76,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）,飞行时间（time of flight，TOF）质量分析器 TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道, 根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测
27、定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比 , 来检测离子。理论上, 只要飞行管有足够的长度, TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。,77,图5-31 MALDITOF分子质谱仪原理图,78,电喷雾质谱（ESI-MS）,1989年, Fenn J B等首次 使用。于2003年获得诺贝尔化学奖。 ESI-MS是利用高电场使质谱进样端的毛细管流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器 。,79,（三） 酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid
28、 system）,也叫做相互作用陷井，是在纽约州立大学建立的双杂交测试技术的基础上，于90年代初期发展出来的一种分析蛋白质与蛋白质相互作用的方法。酵母双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。自建立以来已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法之一。,80,81,酵母双杂交体系的基本原理真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为BD)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD), 共同完成的 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。这两个结构域通过共价或非共介连接建立的空间联系是导致结
29、合和基因转录激活发生的关键。当二者在物理空间上靠近时可再现完整的转录因子活性, 和自然表达转录激活因子一样,82,“诱饵”(bait),“猎物”或靶蛋白(prey or target protein),83,84,酵母双杂交技术的基本原理,已知蛋白编码基因X,编码BD基因,cDNA不同片段Y,编码AD基因,诱饵,猎物,转化酵母细胞,报告基因,表达,不表达,X与Y编码蛋白有无相互作用,有,无,85,生物信息学,是随着人类基因组计划的全面开展和深入二逐渐兴起的一门交叉学科，综合运用生物学、数学、物理学、信息学、计算机科学等学科的基础上发展起来的，通过对分子生物学实验数据的获取、加工、存储、检索和分析，进而达到揭示这些数据所蕴含的生物学意义的目的。,86,第十章 药物代谢组学,代谢组：是指某一生物或细胞在一特定生理时期内所有的低分子量代谢产物。目前主要是相对分子质量1000Da以内的内源性小分子物质。,87,代谢组学,代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。以代谢组为研究对象，是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。,88,研究方法,主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。,89,
