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1、发酵工艺学-淀粉酶发酵,在19世纪早期，许多科学家都在研究谷物提取物中淀粉的消化机理。Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Payen和Persoz（1833年）发现在发酵液的酒精析出物中含有一种对热不稳定的物质，它能使淀粉转化为糖。他们将其称为“diastase”，它就是现代所说的淀粉酶。1886年，Lintner发现了两种淀粉酶-淀粉液化酶和淀粉糖化酶。1924年，Kuhn将淀粉水解酶归为两类。1894 年Tadamin用麸皮培养米曲霉制造淀粉酶作为消化剂, 建立了高峰制药厂。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,1913年
2、法国Bioden与Effront 发明用枯草杆菌生产淀粉酶, 以其耐热性取代了麦芽淀粉酶用于棉布的退浆, 创建了Rapedase工厂。从此酶制剂工业揭开序幕。第二次世界大战后, 随着抗生素工业的发展,微生物的培养技术、发酵工艺和发酵罐的革新, 酶制剂工业有了飞跃的发展, 进人了工业化大生产的阶段。,淀粉是由许多葡萄糖分子以14或16糖苷键连接而成的大分子物质。淀粉有直链淀粉和支链淀粉之分。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,淀粉酶定义：淀粉酶是指一类能催化分解淀粉(包括糖原、糊精等)的糖苷键的酶之总称。包括：淀粉酶、淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、麦芽寡糖生成酶等水解酶类和葡萄糖苷转移酶、环状糊精葡萄糖苷
3、转移酶等。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,高温-淀粉酶,第一节 -淀粉酶第二节 -淀粉酶第三节 葡萄糖淀粉酶第四节 脱支酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,第一节 淀粉酶,(EC3211系统名：-1. 4葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)-淀粉酶是一种内切酶，它随机地从分子内部切开-1.4糖苷键(水解中间的-1.4键比分子末端的-1.4键概率大)，遇到分支点的-1.6键不能切，但能跨越分支点而切开内部的-1.4糖苷键，由于产物的还原性末端葡萄糖残基上的C1碳原子呈-构型(光学)，故称这种酶为淀粉酶。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,一、-淀粉酶的水解反应二、-淀粉酶的基本性质三、-淀粉酶的工业生产,发酵工艺学-淀粉酶发酵,
4、一、 -淀粉酶的水解反应,淀粉在淀粉酶的作用下很快被切割成分子较小的糊精、低聚糖、麦芽糖、葡萄糖等，引起粘度下降，对碘呈色反应为篮紫红无色，又叫液化酶。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,水解产物：,水解直链淀粉，首先将淀粉降解为寡糖、麦芽三糖和麦芽糖，然后将寡糖、麦芽三糖进一步降解为麦芽糖和葡萄糖。水解支链淀粉，由于不能水解-1.6糖苷键，产物除麦芽糖、少量葡萄糖外，还有带-1.6键的小分子极限糊精。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,二、-淀粉酶的基本性质,（一）需要钙离子（二）pH范围（三）温度范围（四）水解极限（五）分子量及其氨基酸组成,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（一）需要钙离子,大多数淀粉酶需要钙离子，钙
5、离子可使淀粉酶保持一定的空间构象，并可增宽其pH范围。NaCL与钙离子同时存在，可显著提高淀粉酶的稳定性。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（二）pH范围,一般淀粉酶的稳pH范围为pH5-10，最适pH范围为pH5-6。另有少量菌种pH范围比较特殊。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（三）温度范围,各种的热稳定性和最适温度也有一定差异。地衣芽孢杆菌产淀粉酶热稳定性最好，最适温度可达90 。枯草杆菌产淀粉酶最适温度为70 。霉菌产淀粉酶最适温度为50。拟内孢霉所产淀粉酶最不稳定， 40即会失活。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（四）水解极限,水解极限:当水解液中还原性不再增加时的水解率，称为该
6、酶的水解极限。各种酶的水解极限随产酶菌种不同有一定差异。水解不同来源的淀粉（支链、直链淀粉含量不同）水解极限也不同。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（五）分子量及其氨基酸组成,-淀粉酶的分子量约为50000左右，但不同来源的酶其分子量和氨基酸组成也有所不同，共同点是含硫氨基酸（如蛋氨酸、胱氨酸）较少，而二羰酸氨基酸（如天冬氨酸、谷氨酸）含量较高。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,三、淀粉酶的工业生产,目前工业大规模生产和应的淀粉酶主要来自枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、和米曲霉。(一)枯草杆菌BF7658 淀粉酶 (二)高温淀粉酶(三)米曲霉固体培养法生产淀粉酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,(一)枯草杆菌BF7658淀
7、粉酶,1、菌种 2、发酵工艺 3、酶的提取,发酵工艺学-淀粉酶发酵,1、菌种,枯草杆菌BF7658于60年代中期投入生产，经一系列诱变后其产酶水平提高至500U/ml。（1）菌株形态 呈短杆状，两端钝圆，单独或成链状。（2）培养基淀粉培养基： 马铃薯培养基：,发酵工艺学-淀粉酶发酵,2、发酵工艺,（1）斜面培养 马铃薯斜面培养基，37 ，3天，此时几乎全部形成孢子，接入种子罐。（2）种子罐培养 37，12-14h，培养至对数生长期（细胞密集、粗壮、整齐）。（ 3）发酵罐 接种量5，工艺特点为低浓度发酵高浓度补料。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,对于固体发酵有以下7个缺点：,1. 限于低湿状态下生长的
8、微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。 2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。 3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵，pH值、湿度、基质浓度不易调控，Biomass不易量测，每批次发酵条件不易一致，再现性差。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。7.
9、 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。 而对于发酵罐深层培养具有生产周期短、产量高、效益大等优点故选用层发酵法生产-淀粉酶。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,3、酶的提取,（1）液体浓缩酶（2）酒精沉淀法制食品级酶（3）淀粉吸附酶（4）盐析法制工业级粗酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（1）液体浓缩酶,发酵液经絮凝过滤后，用薄膜蒸发器浓缩5倍左右，加入食盐18-20，苯甲酸钠0.1-0.3后再滤清，即为液体酶（室温保存3个月，失活10%）。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（2）酒精沉淀法制食品级酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,（3）淀粉吸附酶,将浓缩10倍的酶液拌入淀粉，经筛网摇摆造粒机成型，在沸腾床干燥而成颗粒状制品
10、，亦可将浓缩10倍的酶液添加2的淀粉后喷雾干燥成粉状酶。（4）盐析法制工业级粗酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,(二)高温-淀粉酶：,高温 -淀粉酶是指热稳定性在90 以上的-淀粉酶，它适宜在高温下（100-110 ）将淀粉液化。近年来高温淀粉酶几乎有完全取代枯草杆菌中温-淀粉酶的趋势。 1、菌种 2、生产工艺 3、使用,发酵工艺学-淀粉酶发酵,1、菌种,地衣芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌高温放线菌等,发酵工艺学-淀粉酶发酵,2、生产工艺,以美国Miles公司生产Takatherm酶为例：（1）发酵培养基：乳糖、大豆粉、棉子粉等。（2）接种种龄40h的地衣芽孢杆菌（ 5 ）通风培养100h（3）压滤、超滤
11、、真空蒸发浓缩5倍（4）10下精滤除菌（5）加防腐剂，得到成品酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,提取流程：,发酵工艺学-淀粉酶发酵,3、使用,最适温度90-95 最适pH5.5-7.5每吨淀粉用酶400-600ml，95-100 液化20min，可使30-40淀粉糖浆液化，DE值（还原糖含量）为14-20。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,(三)米曲霉固体培养法生产淀粉酶,（1）斜面培养 米曲汁或麦芽汁斜面培养基，32-34 ，70-72h，此时几乎菌丝全部布满斜面，即成熟，接入种子瓶。（2）种子瓶培养（三角瓶）麦麸玉米粉培养基，32-34，70-72h，培养至长出大量菌丝及黄绿色孢子。（3）种曲培养（曲盒
12、）培养基与种子瓶相同，接种量0.5-1.0，料层厚1cm，培养3天。（4）厚层通风培养 麦麸谷壳培养基接种量0.5，34-36 ，28h。（5）产品培养好的麸曲直接烘干即为工业级粗酶，水浸醇沉后粉碎加糖可作为助消化药物。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,工艺流程,发酵工艺学-淀粉酶发酵,第二节 -淀粉酶,(EC3212系统名：-1.4葡聚糖麦芽糖水解酶)-淀粉酶又称外切型淀粉酶(exoamylase)，它是从淀粉的非还原性末端以麦芽糖为单位顺次分解-1.4糖苷键，同时使切下的麦芽糖还原性末端的葡萄糖残基构型转变成型，故称为-淀粉酶。 -淀粉酶不能水解-1.6糖苷键，也不能跨越-1.6糖苷键，水解作用在
13、-1.6键前2-3个葡萄糖残基处停止。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,一、来源二、-淀粉酶性质三、影响微生物-淀粉酶产生的因素四、植物-淀粉酶的提取,发酵工艺学-淀粉酶发酵,一、来源,-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦甘薯、大豆等高等植物中，目前商品淀粉酶绝大部份均是从植物中提取的，芽孢杆菌淀粉酶生产量极低。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,二、-淀粉酶性质,（一）最适pH：植物来源：pH5-6； 细菌来源：pH6-7（二）作用位点：淀粉的非还原末端-1.4糖苷键（三） -淀粉酶为外切酶（四）作用淀粉时还原性增加，但粘度不易下降，糊化缓慢（五） -淀粉酶较-淀粉酶分子量大（六）水解作用： 1、直链淀粉：可以完全水
14、解成麦芽糖 2、支链淀粉：麦芽糖和大分子-极限糊精,发酵工艺学-淀粉酶发酵,三、影响微生物-淀粉酶产生的因素,(一) 钙离子对-淀粉酶有降低稳定性的作用（但可以增加-淀粉酶活性）。(二) SH 的影响 各种-淀粉酶都含有SH，SH易受封锁剂作用而使酶失活。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,四、植物-淀粉酶的提取,（一）麦麸提取-淀粉酶（二）从甘薯淀粉废液中提取-淀粉酶（三）从大豆蛋白质废水中提取-淀粉酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,第三节 葡萄糖淀粉酶,(EC3213系统名：-1.4葡聚糖葡萄糖水解酶)萄糖淀粉酶又称糖化酶，是一种外切酶，它是从淀粉分子的非还原性末端依次水解-1.4糖苷键切下葡萄糖，它亦可
15、水解麦芽糖的-1.4键和支链淀粉分支点的-1.6键(只是水解速度极慢)，因此从理论上讲，葡萄糖淀粉酶可将淀粉100水解成葡萄糖，故大量用作淀粉的糖化剂。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,发酵工艺学-淀粉酶发酵,一、糖化酶的类型与性质,（一）类型：其生产菌基本都是霉菌，主要有德氏根霉、黑曲霉、拟内孢霉、米曲霉、臭曲霉、雪白根酶等。 分为两大类：一类称为根霉型糖化酶(它对淀粉的水解率为100)。另一类称为黑曲霉型糖化酶(它对淀粉的水解率为80左右) 。（二）糖化酶的最适pH为45，最适反应温度为5060。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,二、糖化酶产生菌的酶系组成,霉菌产生的淀粉酶是一种复合酶，生产糖化酶的菌种(
16、霉菌)同时也生产-淀粉酶和葡萄糖苷转移酶，这三种酶的比例因菌种不同而异，亦会受营养条件，培养条件的变化而变化。（一）米曲霉以产-淀粉酶为主，生产糖化酶、葡萄糖苷转移酶较少。（二）黑曲霉以产糖化酶为主，葡萄糖苷转移酶较强，-淀粉酶较弱。（三）德氏根霉以产糖化酶为主， 淀粉酶较强，不产葡萄糖苷转移酶。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,三、糖化酶的工业生产,我国用液体深层发酵法由黑曲霉生产糖化酶始于1965年，1977年中科院微生物所选育出黑曲霉突变菌株UV-11，产酶活力增加到6000U/ml，此后又以UV-11为出发菌株进行选育，得到多株产酶达10000U/ml的菌株，1995年我国糖化酶产量达14万吨
17、，占全国酶制剂总产量的60。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,(一)黑曲霉液体深层培养法生产糖化酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,(二)根霉固态培养法生产糖化酶,发酵工艺学-淀粉酶发酵,四、去除葡萄糖苷转移酶的方法,1凋节pH法 2吸附法 3表面活性剂处理 4杂多酸或高分子共聚物沉淀法 5氯仿沉淀法 6阳离子交换树脂处理,发酵工艺学-淀粉酶发酵,第四节 脱支酶,(Debranching Enzyme)脱支酶是专一性水解支链淀粉或糖原的-1.6糖苷键，从而将侧枝切下形成长短不一的直链糊精的一类酶。根据对底物的专一性，可将脱支酶分为支链淀粉酶(普鲁兰酶)和异淀粉酶两类。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,一、支链淀粉酶,(普鲁兰酶EC321，4l系统名：普鲁兰6-葡聚糖水解酶)1、普鲁兰酶能水解：普鲁兰糖(微生物生成的由麦芽三糖通过-1.6键连结成线状结构的多糖）的-1.6键；亦可以水解-极限糊精和-极限糊精中由2-3个葡萄糖残基所构成的侧枝分支点的-1.6键；但对于潘糖、异麦芽糖、异潘糖等在-1.6键上只挂一个葡萄糖残基的寡糖或只含-1.6键的多糖是不作用的；亦就是说该酶的最小底物为62-麦芽糖基麦芽糖。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,发酵工艺学-淀粉酶发酵,2、产酶微生物 能生产普鲁兰酶的微生物有产气气杆菌，缓和链球菌、链霉菌和普鲁兰杆菌等。我国的普鲁兰酶大多是用产气气杆菌生产的。,发酵工艺学-淀粉酶发酵,
