微生物发酵过程ppt课件.ppt

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1、Chapter 4. 微生物发酵过程(Microbial Fermentation-Process) 一. 微生物发酵的类型 二. 种子扩大培养 三. 发酵培养基 四. 发酵过程中间分析 五. 发酵终点的判断,微生物发酵的不同类型,一. 微生物发酵的类型,如：黑曲霉发酵生产柠檬酸； 棒状杆菌的Glu发酵； 地衣芽胞杆菌发酵生产聚谷氨酸等,如：乳酸杆菌的乳酸发酵； 梭状芽孢杆菌的丙酮丁醉发酵等,空气,如，酵母厌氧产酒精；好氧积累菌体；,另外，细胞固定化，生物法处理废水，细菌采矿等等;,固定化细胞,Next page,Next page,发酵形式 优 点 缺 点固体 投资少，设备简单，操作容易可因

2、陋就简， 广房面积大劳动强度发酵 因地制宜，利用农副产品以及下脚料作为 大不易机械化操作。 原料进行生产。 液体 液体环境适合菌体生长和物质传递，发酵在均 投资大，设备要求严格， 发酵 质条件下进行，便于控制，液体输送方便，易 动力消耗比较大 于机械化操作，产品易精制 设备占地少，容 量大，可自动控制，适合大规模生产。,固体发酵和液体发酵的区别,固态发酵和液体发酵是微生物发酵的两大技术领域，各具特征，并存在着明显的区别。固态发酵投资少，设备简单，操作容易可因陋就简，因地制宜地利用农副产品以及下脚料作为原料进行生产。液体发酵适合菌体生长和物质传递，发酵在均质条件下进行，便于控制，液体输送方便易于

3、机械化操作，产品易精制同时，液体发酵设备占地少，容量大，可自动化控制，适合大规模生产，具有很大的优势。但是，如能解决好固态发酵的设备问题，固态发酵也将会发挥出更大的作用。,表面发酵和深层发酵 表面培养法 深层培养法放置曲盘需要更多的厂房 利用密闭的发酵罐 需要更多的劳动力 相反 利用抵押空气鼓风机 需要高压空气 动力消耗少 空压机、搅拌耗能 需要简单控制 需要精密控制 很少有污染问题 污染往往成为严重问题产品回收包括水溶、抽提、 相同过滤、离心、蒸发、沉淀 相同,发酵罐进行的间歇操作称为分批发酵。在好氧发酵过程中，需要不断通入无菌空气并加入酸碱以调节发酵液的pH值，除此以外，与外界没有其它的物

4、料交换。分批发酵是一种操作简单并且广泛使用的发酵方式。分批发酵中菌体生长规律及生长参数的数学模型第七章已有详述。工艺变量随时间而变化是该发酵方式的主要特征。摇瓶培养也属分批发酵.分批发酵的主要设备是种子培养罐、主发酵罐、无菌供气系统和产物分离纯化系统。分批发酵的基本过程如图,1. 分批发酵 (Batch Fermentation),2. 补料分批发酵 (Fed-batch Fermentation ) 以某种方式定时向培养系统补加一定营养物质的发酵方式称为补料分批发酵。它是介于分批发酵和连续发酵之间的发酵形式。定时补料的同时并不向外排放发酵液，所以使发酵系统不再封闭，且培养液体积随时间和物料流

5、速而变化。由于营养底物缓慢补入，既满足微生物生长和产物合成的持续需要，又避免了由于底物基质过量所引起的各种调控反应。 定时补充物料，可使培养液中的底物浓度较长时间地保持在一定的范围内，既保证了微生物生长，又不会产生不利影响，从而达到提高容量产率、产物浓度和得率的目的。 补料技术可以采用少量多次、少次多量、流加或微机控制流加；整个发酵过程中不断地调节补料率，维持各项物质的供需平衡。 根据补入物料的组成可将补料分批发酵分为完全补料发酵和半分批补料发酵。完全补料发酵是补入成分完全的培养基。半分批补料发酵是仅补入一种或几种限制性营养成分。,3. 连续发酵 (Continuous Fermentatio

6、n ) 连续发酵是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的体积维持恒定，使微生物细胞处于近似恒定状态下生长的微生物发酵方式。连续发酵的原理及恒化连续培养系统、恒浊连续培养系统在第七章已有所述。下图为典型的实验室连续发酵系统。,连续发酵的最大特点是微生物细胞的生长速度、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生物细胞或产生大量代谢产物的目的。,4. 固态发酵 (Solid State Fermentation ) 固态发酵是指微生物在没有游离水或几乎没有游离水的较湿的固态培养基上的发酵过程。固态的湿培养基一般根据成分不同控制含水量在

7、40-80左右，无游离水流出。农村的堆肥、青饲料发酵和酿酒制曲，就是典型的固态发酵。特别是我国工艺历史悠久、国际著名的白酒生产都有自己独特的固态发酵工艺过程。由于固态发酵方式节能、环保，近来又得到了人们的青睐。如：以产朊假丝酵母（Candida utilis）、面包酵母（Saccharomyces cerevisiae）和啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis）为复合发酵菌种，以麸皮、大豆饼和少量脱毒棉籽饼为原料，经固态发酵法生产饲料蛋白添加剂得到快速发展。 伴随着发酵工程机械化、自动化、化工技术和设备的改进，在传统固态发酵的基础上发展到现在的固态发酵。,现代固态发

8、酵与传统固态发酵的技术比较见下表,现代固态发酵和传统固态发酵的比较,固态发酵生物活性物质,固体发酵和液体发酵的区别,5. 高密度发酵 (High Cell Density Fermentation ) 微生物代谢产物的合成完全是靠菌体作为生产者来实现的。菌体量越多产物的产量也越大。因此，通过发酵工程实现高密度微生物细胞培养则是发酵的最终要求。 采用一定的工艺技术实现了高密度发酵，它不仅使发酵液的菌体浓度比分批发酵提高了10倍以上，而且使菌体的生产能力也处于最佳状态，并能消除有害代谢物对菌体正常发酵的影响。高密度发酵较分批发酵有显著的技术优势。表15-4 列举了几种微生物的高密度发酵结果。,菌

9、种 基础培养基 发酵罐 补料方法 细胞干重(g/L) 培养时间(h),大肠杆菌 葡萄糖矿物 搅拌罐 葡萄糖（甘油） 140-150 30-40 盐或甘油矿物盐 非限制指数补料枯草杆菌 含葡萄糖的完全 搅拌罐 补料分批培养 185 30培养基 补加葡萄糖调节pH毕氏酵母 葡萄糖，矿物盐 搅拌罐 补料分批培养， 100 50-120补加甲醇,高细胞密度发酵成功的实例,高密度发酵生物反应器有常用的搅拌罐和带有外置式或内置式细胞持留装置的反应器，如透析膜反应器、气升式反应器、气旋式反应器等。日本人铃木等用搅拌陶瓷膜反应器系统实现乳酸杆菌高密度培养，其陶瓷过滤器可从发酵液中去除抑制生长的代谢副产物。日本

10、人内野等采用内外两个圆筒的膜透析反应器，能连续去除抑制性代谢产物，始终保持菌体生长繁殖。 补料技术常用于高密度发酵，对提高菌体密度效果明显。有人采用三阶段式流加葡萄糖，高密度培养大肠杆菌重组菌株（YK537/pDH-B2m），菌体密度达到53 OD600，骨形成蛋白（BMP-2A）产量达到2.78g/L。但有些菌体高密度发酵菌体浓度较理论浓度尚有距离，仍需深入研究。,6. 基因工程菌的发酵 (Recombinant strain fermentation ) 分子生物学技术特别是重组DNA技术的快速发展，众多的基因工程产品相继问世。下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途。 工程菌常以大

11、肠杆菌、枯草芽孢杆菌、某些假单胞菌、酵母菌、哺乳动物细胞等作为外源基因受体，其发酵培养与普通菌种的好气培养没有本质的差异。基因工程菌通常采用二阶段发酵培养工艺，先在一定时间内提高菌体浓度，其后添加诱导物或改变培养温度而诱导外源基因的产物表达，并以综合评价决定产物表达的最佳诱导条件。 基因工程技术日臻成熟，所构建的工程菌已实现发酵生产，很多产品已投放市场。如：胰岛素、干扰素、生长激素、乙型肝炎疫苗、高产苏氨酸等。有的基因工程菌其产品产量已高于普通菌种。一种带有头孢菌素生物合成限制性扩环酶外源基因的工程菌，其头孢菌素C的产量比原有菌种提高了15%。,下表列举了部分基因工程菌发酵产生的药物及其用途,

12、重组原核微生物生产的部分蛋白药物,1. 现代发酵技术的特点: (1) 发酵工程与化学工程更紧密的结合。 (2) 发展酶，细胞的固定化技术。 (3) 遗传工程技术的应用，使得定向育种真正成为可能 (4) 计算机等自控技术的应用，提高了整体水平2. 典型的发酵生产过程（见下页图）: (1) 原料的予处理: 淀粉质原料: a. 酸解: 原料(淀粉+水+HCL)-调浆-(加热)-糖化-冷却-中和, 脱色-过虑除菌-糖液。 b. 酶解: 原料(淀粉+水)-调浆-(加酶加热)-液化-降温-(加酶 加热)-糖化-糖液 糖蜜类原料: a. 酵母生产: 浓糖蜜(40Be0)-稀释至17-18Be0-酸化(pH3

13、.9)- 水解(0.1MPa, 5min)-石灰乳调pH(4.4-4.8)-静止24h- 沉淀与上清-上清液中-加营养盐-灭菌 b. 柠檬酸发酵: 浓糖蜜(40Be0)-稀释1倍-加热(50-550C) -加 浓H2SO4(1%)-加热(大于900C, 10 min)-澄清-沉淀与上- 取上清液-稀释至含糖11%-加NH4NO3(0.15%)-灭菌,二. 微生物发酵的一般过程,典型的分批微生物反应工艺流程图,(2) 种子扩大培养: a. 固体发酵: 活化斜面-三角瓶-发酵原料 b. 好气性液体发酵: 活化斜面-摇瓶液体种子（或茄型瓶种子）-种子罐（1，2级） -发酵罐。 c. 厌气液体发酵:

14、静止培养法（以丙酮丁醇发酵为例） 活化斜面-不同水平三角瓶的逐级培养 (20mL-100mL-500mL)-6 L 卡氏 瓶-200L卡氏罐-5000L发酵罐。(3) 基本操作方式: a. 分批操作(间歇操作): b. 半分批操作(流加法),反复半分批操作(反复流加法): c. 连续操作:(4) 产品的分离提取（后处理）: a. 酵母生产: 发酵液-连续离心-板框过虑-干燥 b. 味精生产: 发酵液-离子交换-浓缩-结晶-洗涤-重结晶-干燥-筛分 c. 酶制剂: 发酵液-喷雾干燥(粗品) d. 酒精与丙酮丁醇: 醪液-蒸溜(粗,精) e. 柠檬酸: 发酵液-加热-板框过虑-CaCO3-中和-H

15、2SO4-酸解, 活性碳脱色- 离子交换-浓缩-结晶-干燥,三. 发酵生产中的种子质量控制1. 种子培养基和培养条件: 种子培养基:能保证在生产中获得大量优质孢子或营养细胞，对于种子培 养基的要求: 营养成分完整，丰富，氮源比例高; 原料较精，总 浓度较低; 主要成分尽可能同发酵培养基一致； pH较稳定利于菌 体正常生长和发育。 培养条件: 适当控制pH温度，通气和搅拌等条件，尽可能与发酵罐的 起始条件相似。2. 对接种物的一般要求: 具有旺盛的增殖能力，达到较高的菌体浓度； 纯度高，个体整齐，同步率高，生理活性强，无杂菌 性能稳定，不易变异，退化 质量判断: pH, 菌体形态，菌体浓度，产物

16、量，酶活性，培养液外观3. 影响种子质量的因素: 原材料质量；培养条件；温度； 湿度；通气量； 斜面冷藏时间；培养基；pH值等。,4. 种子质量的控制 种令，种子罐数，接种量； 在种子生理状态和培养条件相同时 菌种稳定性检查； 接种量越大发酵延滞期越短。 杂菌检查； 接种技术 5. 决定种子扩大级数的因素 菌种的增殖速度；最低接种量; 发酵规模；种子罐与发酵罐的容积比6. 种子制备的放大原理与技术 种子扩大培养的主要目的：是为了获得大量的活力强的种子，以便在发酵罐的发酵培养过程中尽可能地缩短延迟期。延迟期的长短与种子的接种量、接种龄及其生理条件的影响。种子最好采用处于对数生长期的菌种。此时的微

17、生物细胞具有较强的代谢活力。种龄对于能生成芽孢的种子尤为重要。（因为芽孢是在对数生长后期开始形成的，如接种物中含有大量芽孢，则给随后的发酵带来较长的延迟期）。两个例子如下： 枯草芽孢杆菌生产杆菌肽发酵时种子扩大培养的程序 梭状芽孢杆菌进行丙酮丁醇发酵时种子扩大培养的程序,枯草芽孢杆菌生产杆菌肽发酵时种子扩大培养的程序,级数 培养条件 培养时间 1 保藏菌种-4.0L摇瓶 18-24h 2 一级培养物-750L罐 6h 3 二级培养物-6000L罐 培养形成最大生物量 4 三级培养物-12000L罐 培养形成最大生物量,梭状芽孢杆菌进行丙酮丁醇发酵时种子扩大培养的程序,级数 培养条件 培养基 1

18、 保藏菌种接种后培养24h 马铃薯葡萄糖肉汤 2 一级培养物-600mL 20-24h 糖4%，硫酸铵5%，碳酸钙6% P2O5(以磷酸盐形式提供) 3 90mL二级-含有3000mL液体锥形瓶 同二级 4 三级培养物-25000L罐 糖6%其余同二级 5 四级- 300000 500000L罐 同四级，发酵中补充氨水 接种量 0.5 3%,四. 发酵培养基(P88-92)1. 概念 ； 2. 发酵培养基的特点； 3. 发酵培养基的组成 4. 培养基的设计和最优化 (1) 培养基成分的选择； (2) 培养基的设计和配制； (3) 限制因子的鉴定。五. 发酵过程中的中间分析 1. 分析项目: 1

19、) 产量 (U/mL, %, g /L); 2) pH值; 3) 糖量(总糖，残糖); 4) 氮量(无机氮，有机氮，硝基氮); 5) 菌体形态: 种子阶段：掌握合适种令，确保优质种子； 发酵阶段:观察生长是否正常，以便选择合适发酵条 件如果发现不正常，则设法补救，及时发现杂菌污 染，及早控制或处理。2. 发醇终点判断: 生产率:kg/m3h; 得率:kg产物/kg基质(转化率); 发酵系数:kg产物/罐容积m3发酵周期 h,正交实验 利用软件的响应面法,3. 放罐时间的确立考虑的因素: 1) 提高发酵生产率，降低成本，不影响产品取质量;2) 放罐前的控制;3) 发醇异常的处理 a 发酵液转稀:

20、现象；粘度下降，泡沫上升，消沫效果减弱; 原因: 噬菌体侵染或其它未知因素；措施：适时补入适当碳源或氮源促使繁殖新菌体，恢复正常 b 发酵液过浓:原因：氮源过多，菌体过剩，溶解氧下降; 措施: 补入10%无菌水，使菌液浓度下降，粘度下降，改善发酵条件。 c 耗糖缓慢:原因:种子质量，灭菌质量，磷盐浓度低。 措施:补入适量合适的氮源，磷盐，提高发酵温度，风量； d pH不正常: 原因: 灭菌质量，原料质量，水质，通气，补料；措施：酸或碱调整。,案例-PGA发酵200.0 L发酵试验1. 培养基配方（g/L）：（1）一级种子培养基（600 ml）：LB：蛋白胨 10，酵母粉5，NaCl 5, pH

21、 7.07.2；（2）二级种子培养基（6 L）：同上；（3）发酵培养基（120 L）：蔗糖50，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 6，MgSO4 0.6，酵母粉 0.417；2. 发酵条件： LL3活化培养基中挑取单菌落，接至L管中，140 rpm振荡培养12 h后，按1%接种量接至500 ml三角瓶中，每瓶装液100ml，摇床培养1620 h至OD600nm2.0；按照10%接种量接至装液6 L的10 L发酵罐，转速150 rpm，通气量0.71vvm，培养约20 h；按照5%接种量至200 L发酵罐中，转速为200 rpm，通气量1vvm，发酵48 h，温度 37，pH 7.0。调节）

22、，转速200 rpm，每8 h取样，发酵48 h。,3. 参数测定：（1）菌体浓度：OD600nm：采用岛津紫外分光光度计测定（2）菌体干重：发酵液离心后，菌体冷冻干燥后称重（3）粘度变化：离心菌体后的上清使用Brookfield粘度计S00转子，60 rpm条件下测定（4）PGA处理与产量：每个4h所取样4倍体积无水乙醇沉淀后，分别采用800010000 Da的膜透析和不透析两种方法提取，冷冻干燥称重；原发酵液采用0.2m微滤膜过滤，6000Da反复浓缩后醇沉（5）pH值变化：采用发酵罐pH电极直接测定（6）溶解氧浓度：由发酵罐记录数据（7）蔗糖残留浓度：采用紫外吸收光谱法。一定浓度蔗糖标准

23、液或样品（样品去蛋白）+15 ml 6N盐酸+蒸馏水混合定容至20 ml，沸水浴约10min，根据酸水解蔗糖后的果糖受热破坏，生成的产物5-羟甲基呋喃甲醛在285nm处特征吸收峰进行测定。,六. 主要技术经济指标 1. 发酵率：表示发酵过程中化学及生化反应的动态变化，几种重要的物质变 化速率。即：基质消耗、菌体生长和终点产物浓度改变的瞬时速率。 2. 发酵率的测定：发酵率的测定一般着重在菌体生长、基质利用和产物的形 成三个方面，即发酵率是由“生长率”，“代谢率”和“生产率”组成。 (1) 生长率-以菌体生长代表各种酶的总催化活力(), g/gh (2) 代谢率-表示菌体代谢变化情况(Qc, Qs, QO2), g/gh (3) 生产率-是以发酵时间除最后产物浓度之商，Qp g/gh 3. 发酵率的表示 发酵率可以以体积为计量单位，表示浓度（单位体积的产物量）随时间变化 速率，称为“体积率”，其单位是产物量/体积 时间。发酵率还可以菌体量作 为单位，称为“比速率”，其单位为菌体量/单位菌体量 时间，用作发酵动力 学分析。 常见的具体技术经济指标有： （1）容量产率-单位时间内单位反应器的产物量 (g产物/Lh) （2）转化率-单位底物产生的产物量 (%)(kg产物/kg基质) （3）产物浓度-单位体积发酵液所含的产物量 (g/L%),