发酵工程第六章发酵动力学.ppt

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1、第六章,发酵动力学,什么是发酵动力学？,发酵动力学：是对微生物生长和产物形成过程的定量描述，研究微生物生长、产物合成、底物消耗之间动态定量关系，定量描述微生物 生长 和 产物形成 过程。主要研究：1、发酵动力学参数特征：微生物生长速率、发酵产物合成速率、底物消耗速率及其转化率、效率等；2、影响发酵动力学参数的各种理化因子；3、发酵动力学的数学模型。,认识发酵过程的规律优化发酵工艺条件，确定最优发酵过程参数，如：基质浓度、温度、pH、溶氧，等等提高发酵产量、效率和转化率等,研究发酵动力学的目的,发酵动力学研究的基本过程,首先研究微生物生长和产物合成限制因子；建立细胞生长、基质消耗、产物生成模型；

2、确定模型参数；实验验证模型的可行性与适用范围；根据模型实施最优控制。,本章主要内容,分批发酵动力学连续发酵动力学补料分批发酵动力学,6.1 分批发酵动力学,分批发酵动力学主要研究微生物在分批发酵过程中生长动力学、基质消耗动力学和代谢产物生产动力学。,什么是分批发酵？,分批发酵：准封闭培养，指一次性投料、接种直到发酵结束，属典型的非稳态过程。,典型的分批发酵工艺流程图,分批发酵过程,分批发酵动力学,细胞生长动力学底物消耗动力学产物形成动力学,微生物细胞倍增时间与群体生长动力学细菌：典型倍增时间1hr酵母：典型倍增时间2hr放线菌和丝状真菌：典型倍增时间48hr 微生物细胞群体生长动力学是反映整个

3、群体的生长特征，而不是单个微生物生长倍增的特征。因此，菌龄是指一个群体的表观状态。,关于菌龄的描述,所谓细胞生长动力学是以研究菌体浓度、限制性基质（培养基中含量最少的基质，其他组分都是过量的）浓度、抑制剂浓度、温度和pH等对菌体生长速率的影响为内容的。在分批发酵中，菌体浓度X,产物浓度P和限制性基质浓度S均随时间t变化,三、微生物生长速率与底物浓度的关系,分批发酵过程中，微生物生长通常要经历：延滞期、对数生长期、衰减期、稳定期（静止期）和衰亡期五个时期。,t1 t2 t3 t4 t5,分批发酵时典型的微生物生长动力学曲线,菌体浓度X,时间 t,分批发酵动力学-细胞生长动力学,ABOUT LAG

4、 PHASE（延迟期）,在发酵工业生产中，为了提高生产效率，希望延迟期缩短，要达到该目的，应一般遵循下列规则：(1).接种的微生物应尽可能是高活力的。要用处于对数期的微生物作种子.(2)种子培养基和条件应尽可能接近生产上使用的发酵液组成和培养条件。(3)建议采用大接种量。因细胞内部的某些维生素和辅酶等生长素，向周围培养液扩散，从而降低细胞的活性，延长延迟期。,About Exponential Phase：对数生长期的微生物生长速率正比于原有的微生物数，微生物生长特性通常以细胞浓度或细胞数量倍增所需的时间来表示，因此可以直接得出微生物的基本生长动力学方程：x=，=。,指数生长期,微生物生长特性

5、通常以单位细胞浓度或细胞数量倍增所需要的时间来表示（、n）：,或,X细胞浓度（g/L）；N细胞个数；t生长时间；X0、Xt初始微生物浓度和t时细胞浓度；N0、Nt初始细胞个数和t时细胞个数；以细胞浓度表示的比生长速率；以细胞数量表示的比生长速率。,分批发酵动力学-细胞生长动力学,经过一段时间的培养后，由于营养的限制，微生物生长速率逐渐衰减，即进入生长衰减期，最终出现微生物净生长速率为零，微生物进入静止期。稳定期细胞生长和死亡处于动态平衡，净生长速率为0.衰亡期，比死亡速率大于比生长速率。,在对数期是常数，取得最大值，在其它生长期不是常数。分析各生长不同时期的数值。Lag Phase：x无净生长

6、，0；加速生长期：x增加，21；Exponential Phase：x对数增加，常数；减速生长期：x增加缓慢，43；Stationary Phase：x无净生长，0；Death Phase：x减少，0。,在分批发酵体系中，可以通过探究在一定底物浓度范围内的微生物生长情况，来了解微生物生长受底物浓度限值的特性。,分批发酵中初始底物浓度对稳定期菌体浓度的影响,AB区：菌体浓度与初始底物浓度成正比，有：,X为菌体浓度，为针对底物的细胞得率，初始X0为零；S0为底物初始浓度；St为底物残留浓度。,BC区：随S0增加，菌体浓度达最高水平，再增加S0，菌体不再增加。C区：菌体活性受初始高浓度底物及高渗作用

7、抑制，菌体浓度与初始底物浓度成反比。,高浓度底物抑制的情形,Decline（开始出现一种底物不足的限制）:(1)若不存在抑制物时 Monod 模型:,分批发酵动力学-细胞生长动力学,式中:S限制性基质浓度，mol/m3Ks底物亲和常数(也称半饱和速度常数），表示微生物对底物的亲和力,mol/m3；Ks越大，亲和力越小，越小。当S较高时，(对数期满足S10Ks)，此时，=m 当S较低时，(减速期，S10Ks)，此时S，减速期，,分批发酵动力学-细胞生长动力学,1949年Monod发现，细菌的比生长速率 与单一限制性底物之间存在这样的关系：,比生长素率,限制性底物残留浓度St,残留的限制性底物浓度

8、对微生物 比生长率的影响,表征与培养基中残留的生长限制性底物St的关系,Monod方程：,Ks底物亲和常数，等于处于1/2m时的底物浓度，表征微生物对底物的亲和力，两者成反比。,：菌体的生长比速S：限制性基质浓度Ks：底物亲和常数max:最大比生长速度,单一限制性基质：就是指在培养微生物的营养物中，对微生物的生长起到限制作用的营养物。,限制性底物是培养基中任何一种与微生物生长有关的营养物，只要该营养物相对贫乏时，就可能成为限制微生物生长的因子，可以是C源、N源、无机或有机因子。,Monod 方程是典型的均衡生长模型，其基本假设如下：（1）描述细胞生长的唯一变量是细胞浓度X，（2）培养基中只有一

9、种基质是生长限制性基质，其它组分均过量，（3）细胞的生长视为单一反应，细胞得率为常数，当S Ks 时，=m S/Ks，与S是一级动力学关系，（4）SKs，=m，与S是零级动力学关系。,Monod研究了基质浓度与生长速度的关系Monod方程(1949),米氏方程:,莫诺方程表面上与米氏方程同型。但是Monod方程来自于对实验现象的总结，而米氏方程是根据酶促反应机理推导出的。前者是经验方程，后者是机理方程。,Monod方程的参数求解(双倒数法)：,将Monod方程取倒数可得：,或：,这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。但在低S值时

10、，的偏差较大，影响Ks值的精度。第二方程好用一些，在低S值时精度高，也可用回归方法。,Monod方程的意义,当S Ks,-S是线性关系，与S成正比。当S Ks，max，此时微生物的生长不受限制基质的影响。,对某一钟微生物在某种基质条件下，max 和Ks 是一定值。不同的微生物有不同的max 和Ks。即使同一种微生物在不同的基质种也有不同的max 和Ks。Ks越大，表示菌体对基质的亲和力越小。,Monod方程应用：测定微生物对不同底物的亲和力大小（Ks值）实验确定适于微生物生长的最佳底物（？）比较不同底物发酵最终残留的大小（？）比较不同微生物对同一底物的竞争优势，确定连续培养的稀释率,KS越大，

11、表示微生物对营养物质的吸引亲和力越小，反之越大。对于许多微生物来说，KS值是很小的，一般为0.1120mg/l或0.013.0mmol/l，这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。,基质消耗动力学,基质包括细胞生长与代谢所需的各种营养成分，其消耗分为三个方面：细胞生长，合成新细胞；细胞维持生命所消耗能量的需求；合成代谢产物。,发酵动力学发酵动力学涉及的常规参数,2、得率(或产率，转化率，Y)：是指被消耗的物质和所合成产物之间的量的关系。包括生长得率(Yx/s)和产物得率(Yp/s)。生长得率：是指每消耗1g(或mo1)基质(一般指碳源)所产生的菌体重量(g)，即Yx/s=X/S产物得率：是指

12、每消耗1g(或mo1)基质所合成的产物的克数(或mol数)。这里消耗的基质是指被微生物实际利用掉的基质数量。,菌体生长速率为,底物消耗速率为,产物生成速率为:,3、有关速率的概念,4、有关比速率的概念,基质比消耗速率qs,g(或mo1)g菌体h：系指每克菌体在一小时内消耗营养物质的量。它表示细胞对营养物质利用的速率或效率。产物比生产速率qp，g(或mo1)g菌体h：系指每克菌体在一小时内合成产物的量，它表示细胞合成产物的速率或能力，可以作为判断微生物合成代谢产物的效率。,细胞生长的比速率为：,底物消耗的比速率为qs,产物形成的比速率为qp：,根据发酵时间过程分析，微生物生长与产物合成存在以下三

13、种关系：与生长相关生长偶联型与生长部分相关生长部分偶联型与生长不相关无关联,分批发酵动力学-产物形成动力学,相关型,部分相关型,与生长相关生长偶联型：乙醇发酵,产物的生成是微生物细胞主要能量代谢的直接结果，菌体生长速率的变化与产物生成速率的变化相平行。,分批发酵动力学-产物形成动力学,与生长部分相关生长部分偶联型：柠檬酸、氨基酸发酵,产物间接由能量代谢生成，不是底物的直接氧化产物，而是菌体内生物氧化过程的主流产物（与初生代谢紧密关联）。,分批发酵动力学-产物形成动力学,与生长不相关无关联：抗生素发酵,若考虑到产物可能存在分解时，则,产物生成与能量代谢不直接相关，通过细胞进行的独特的生物合成反应

14、而生成。,分批发酵动力学-产物形成动力学,习惯上把与生长无关联的产物称为次级代谢产物，他们的合成发生在生长停止之后。次级代谢作用的一个重要特征是，产物的生成只有在生产菌处于低的生长速率条件下才能发生。所以生长速率有可能是分解代谢产物的阻抑作用因子，而与营养限制无关。,杀假丝菌素分批发酵动力学分析,杀假丝菌素分批发酵中的葡萄糖消耗、DNA含量和杀假丝菌素合成的变化。,应用举例,分批发酵的优缺点,优点：操作简单、投资少运行周期短染菌机会减少生产过程、产品质量较易控制缺点：不利于测定过程动力学，存在底物限制或抑制问题，会出现底物分解阻遏效应?及二次生长?现象。对底物类型及初始高浓度敏感的次级代谢物如

15、一些抗生素等就不适合用分批发酵（生长与合成条件差别大）养分会耗竭快，无法维持微生物继续生长和生产非生产时间长，生产率较低,连续发酵动力学,什么是连续发酵？,连续发酵概念：在发酵过程中，连续向发酵罐流加培养基，同时以相同流量从发酵罐中取出培养液。连续发酵特点：添加培养基的同时，放出等体积发酵液，形成连续生产过程，获得相对稳定的连续发酵状态。连续发酵类型：单级 多级连续发酵,（一）连续发酵类型及装置（二）连续发酵动力学模型1.单级恒化器连续发酵2.多级恒化器连续发酵（三）连续发酵动力学理论的应用及存在问题,主要内容,连续发酵类型及装置 罐式连续发酵 单级 多级串联 细胞回流式 塞流式连续发酵,连续

16、发酵动力学-发酵装置,单级连续发酵示意图,连续发酵动力学-发酵装置-单级,两个及以上的发酵罐串联起来，前一级发酵罐的出 料作为下一级发酵罐的进料。,连续发酵动力学-发酵装置-多级串联,两级连续发酵示意图,罐式连续发酵实现方法恒浊法：通过调节营养物的流加速度，利用浊度计检测细胞浓度，使之恒定。恒化法：保持某一限制性基质在一恒定浓度水平，使菌的比生长速率保持一定。,多级罐式连续发酵装置示意图,连续发酵动力学-发酵装置-多级串联,a:再循环比率（回流比）c:浓缩因子,细胞回流的单级连续发酵示意图,连续发酵动力学-发酵装置-细胞回流式,发酵罐,培养物流出,无菌培养基流入,供给连续接种再循环,d,连续发

17、酵动力学-发酵装置-塞流式,定义：稀释率 D=F/V(h-1)F流量（m3/h）V原有培养液体积（m3）理论停留时间,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞的物料衡算（和D的关系）,对于单级恒化器：X0=0 且通常有：,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,积累的细胞（净增量）=流入的细胞-流出的细胞+生长的细 胞-死亡的细胞,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,A.稳定状态时(恒浊培养）,此时=D（单级连续发酵重要特征）,B.不稳定时，,当D，,当D，,积累的营养组分=流入量-流出量-生长消耗量-维持生命需要量-形成产物消耗量稳态时（恒化培养），=0,一般条件下,mx 产物

18、相对菌体生长量较少,限制性基质的物料衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,稳态时,单级连续培养两个稳态方程是：,限制性基质的物料衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,两个稳态方程隐含了几点假设：Yx/s 对于一个特定微生物及具体操作参数(D)来讲是常数Yx/s只受一种限制性营养基质S的影响：S一定，一定，则Yx/s一定,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,恒化器 是一种使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养装置。称为外控制式的连续培养装置，通过控制某一种营养物的浓度，使其始终成为生长限制因子的条件下达到的稳态连续培养。

19、这样，既可获得一定生长速率的均一菌体，又可获得虽低于最高菌体产量，却保持稳定菌体密度的菌体。在恒化器中，一方面菌体密度会随时间增长而增高，另一方面，限制生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速流入的新鲜培养基流速相平衡。,(2)恒浊器 是根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器。可称为内控制式的连续培养装置，当培养基的流速低于微生物生长速度时，菌体密度增高，这时通过光电控制系统的调节，可促使培养液流速加快，反之亦然，并以此来达到恒密度的目的。因此，这类培养器的工作精度是

20、由光电控制系统的灵敏度来决定的。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度。在生产实践上，为了获得大量菌体或与菌体生长相平行的某些代谢产物如乳酸、乙醇时，都可以利用恒浊器。,恒浊器,恒浊器与恒化器的比较,细胞浓度与稀释率的关系（x与D的关系）临界稀释率Dc导致菌体开始从系统中洗出时的稀释率，当流入底物浓度为S0 时，临界稀释率Dc为：,稀释率D的大小不能超过连续发酵系统的临界稀释率,如果取 DDC，则会出现：DDC由 可知 负增长，x，进入非稳态，菌体最终被洗出，即x=0 时，达到“清洗点”，此时，,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞浓度与

21、稀释率的关联（X与D的关系）,应用Monod方程，此时，,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,生长模型,由两个稳态方程可以推出D与X关联的生长模型 当DDC 时，细胞衡算 底物衡算,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞生产率,细胞生产率 当 即 时,可获得最大的细胞生产率，为,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,细胞生产率,若S0Ks（S010Ks）,底物供给浓度很大，为非限制性则 此时，最大临界稀释率 当DDc=时，,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,x,s,Dx与D关系总结：,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,产物的物料衡算,产物变化率=细胞合成产物速

22、率+流入-流出-分解项 当连续发酵处于稳态，且加料中不含产物，即，P分解速率可忽略。得,连续发酵动力学-理论-单级恒化器连续发酵,图6-9、6-10 Ks值与细菌连续培养特征的关系,多级连续发酵,多级恒化器的优点：在不同级的罐内可以预先设定不同的培养条件，这将有利于多种碳源的利用和次级代谢产物的生产。例如：产气雷白菌，第一级：葡萄糖；第二级：麦芽糖,连续培养在工业中的应用,连续发酵中，可采用能达到最大菌体产率DX的稀释速率。图6-13.分批发酵时，最大菌体生产能力出现于发酵终点；连续培养时，以最适稀释速率使培养处于稳定条件下，细胞的生产能力成为一个常数。,连续培养过程中的主要问题,连续发酵过程

23、具有许多优点：在连续发酵达到稳定状态之后，其非生产时间几乎等于0，因此设备利用率高；操作比较简单；产品质量比较稳定；对发酵设备以外的外围设备（如蒸汽锅炉、泵）的利用率高；可以及时排出在发酵过程中产生的、对发酵过程有害的物质等。,连续发酵技术也存在一些问题，其中最主要的是菌种的稳定性问题：杂菌污染生产菌株突变,杂菌污染问题,在连续发酵过程中，需要长时间连续不断地向发酵系统供给无菌的新鲜空气和培养基，这就不可避免地发生杂菌污染问题。杂菌污染问题是连续培养中难以解决的问题。要了解污染的杂菌在什么样的条件下会在系统中发展成为主要的微生物群体。,假设连续培养系统被外来的生物Y、Z和W污染，这些污染菌的积

24、累速率可用以下物料平衡式表示：污染菌积累的速率污染菌进入的速率污染菌流出的速率污染菌生长速率 式中X是污染菌Y、Z和W的浓度，在稀释率为D时的残留限制性基质浓度为S。,将污染的生物Y、Z和W的生长速率基质浓度曲线与连续培养系统中作为生产菌的生物X的曲线作比较，分别示于图（a）、(b)、(c)。,由于限制性养分浓度是S，生物Y的生长速率 比系统的稀释率D要小（图a）。因此Y的积累由下式表示：结果是负值，污染物Y不能在系统中存留。这是一次性污染，没有造成持续污染。,污染物Z的生长速率与基质浓度的关系则与图a中的有显著不同。在基质浓度为S的情况下，生物Z能以比D大的比生长速率 生长。生物Z的物料平衡

25、为：,生物W侵入的成功与失败决定于系统的稀释速率。在稀释率为0.25Dc下(式中Dc是临界稀释速率)，W竞争不过X，W被冲走；如果稀释率增加到0.75Dc，污染物W将和Z一样有竞争力，而原来的菌被冲走。,在培养基浓度高时，造成杂菌积累，X被洗出，W成为杂菌污染。在培养基浓度低，D也较小情况下，可以淘汰W。所以在了解杂菌性能后，既要控制稀释率D，又要控制培养基浓度来排除杂菌污染。,在分批培养中，任何能在发酵培养液中生长的污染物将存活和开始积累，但在连续培养中污染物能否生长取决于它在培养环境中的竞争能力。因此用连续培养技术可选择性地积累一种能有效使用限制性养分的菌种。,2.生产菌株突变问题,微生物

26、在复制过程中难免会出现差错引起突变，一旦在连续培养系统中的生产菌细胞群体中的某一个细胞发生了突变，而且突变的结果使这一细胞获得在给定条件下高速生长的能力，那么它就有可能像杂菌Z一样，取代系统中原来的生产菌株，而使连续发酵过程失败。,应用,有助于了解和研究细胞生长、基质消耗和产物生成的动力学规律，从而优化发酵工艺。便于研究细胞在不同比生长速率下的特征。,连续发酵动力学-理论,利用细胞再循环连续发酵技术进行废水的生化处理、发酵与产物分离耦合。利用连续培养的选择性进行富集培养菌种选择及防污染处理。,应用,连续发酵动力学-理论,实验数据如下：t 24h(生长罐）48h（生产罐）60h P1=0.07g

27、/L P2=0.4g/L P3=0.62g/L X1=7g/L 求操作参数D？并比较连续发酵与分批发酵的生产率。,应用-青霉素连续发酵与分批发酵对比,计算：采用连续发酵时第一罐：第二罐：由,为了保证串联稳定，两罐稀释率差异用体积差异进行调节。F相同 产物在串联系统停留时间 产物形成速率,而分批发酵时，tn=48h,P=0.4g/L故产物形成速率 DP=0.4/48=0.0083g/Lh（比连续发酵低）为充分利用基质，再加一罐(第三罐)(相当于60h),tn=1/D1+1/D2+1/D3=53.7h产物形成速率 P3/tn=0.0115g/L h分批发酵 P3/t3=0.62/60=0.0103

28、g/L h,什么是补料分批发酵？,补料分批培养（Fed-batch culture）：分批发酵过程中补充培养基，不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液的体积随着发酵时间逐渐增加。,概念：在发酵过程中，不连续地向发酵罐内加入培养基，但不取出发酵液的发酵方式。特点：由于培养基的加入，发酵液体积不断增加。,补料分批发酵动力学,半连续发酵概念：在发酵过程中，每隔一定时间，取出一定体积的发酵液，同时在同一时间间隔内加入相等体积的培养基，如此反复进行的发酵方式。特点：稀释率、比生长速率以及其它与代谢有关的参数都将发生周期性的变化。,补料分批发酵动力学,类型,连续流加补料方式 不连续流加 多周期流加 快速流加

29、恒速流加 变速流加 单一组分补料 多组分补料,流加方式,补料分批发酵动力学,以补加的培养基成分来区分,整个发酵罐中细胞、限制性基质和产物总量的变化速率可用下式表示：,补料分批发酵动力学,细胞总量的变化率为 若为恒速流加，培养基流量为F，则 合并、式 得,补料分批发酵动力学,同样可以推导出限制性基质和产物浓度的变化率：合并、式 得,补料分批发酵动力学,又,补料分批发酵动力学,拟稳态时 这时,补料分批发酵动力学,对于恒速流加，细胞的比生长速率对时间的变化率为：长时间流加培养之后,补料分批发酵动力学,优点,可以解除底物的抑制、产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应。避免在分批发酵中因一次性投糖过多造成细胞大量生长，耗氧过多，以至通风搅拌设备不能匹配的状况。菌体可被控制在一系列连续的过渡态阶段，可用来作为控制细胞质量的手段。与连续发酵相比，补料分批发酵的优点在于：无菌要求低；菌种变异，退化少；适用范围更广。,补料分批发酵动力学,分批、连续、补料操作方式的比较,补料分批发酵的应用,1、消除分解阻遏作用，保障通气条件和生产能力；2、降低高浓度培养基的抑制作用，延长发酵生产时间。,