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1、酶与细胞的固定化技术,酶应用过程中的一些不足,酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,酶的固定化,1、什么是固定化技术和固定化酶,2、固定化酶的研究历史,3、
2、酶的固定化技术,4、固定化酶的特点,Go,Go,Go,Go,固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。,1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。3.分离纯化困难。,游离酶的缺点：,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶（固定化酶）,固定化技术,固定化酶,固定化酶：是指借助物理或化学方法将酶固定在载体上，并在一定的空间内进行催化反应的酶。固定化酶可以连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶形状：颗粒、线条、薄膜和酶管等。固定化菌体,优点：1）可提高稳定性；2）
3、能回收，易与产物分离，可反复使用；3）可连续化生产操作；4）可实现最优化控制；5）酶可以再生利用。缺点：1）酶固定化后酶活力有损失；2）只能用于可溶性小分子底物；3）与完整细胞比较，不适于多酶反应。,制备固定化酶的依据,固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。固定化酶应有最大的稳定性。定化酶应易与产物分离。,酶的固定化方法,1、吸
4、附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。 常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。,优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。缺点：结合力弱，易解吸附。,2、结合法选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。,根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某
5、些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化。,第一个离子结合法固定化酶：DEAE-Cellulose固定化过氧化氢酶第一个工业化的固定化酶：DEAE-Sephadex A-50固定化氨基酰化酶,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,
6、共价结合法（covalent binding or covalent coupling）,1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,使载体活化的方法很多，主要的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,3、交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。,戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫
7、（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶
8、分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,缺点：(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,4. 包埋法,将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为：网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。,1）网格型包埋法（gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法：
9、 滴至角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC)聚丙烯酰胺凝胶包埋法： APAcr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED,2）微囊型包埋法（microencapsulation） 又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。 半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。,与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点：1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭
10、蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比：优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,各种固定化方法的优缺点比较,固定化酶性质,固定化对酶稳定性影响：1）对热稳定性提高；2）对变性剂、抑制剂的耐受性提高；3）对蛋白酶抵抗能力增加、储存稳定性和操作稳定性有所增强。最适温度：一般与游离酶相似。最适pH：受载体带电性和产物性质等最适pH会受一定影响。底物特异性：是否变化与底物的分子质量大小有一定关系。米氏常数：固定化酶的表观米氏常数随载
11、体带电性能而变化。,固定化酶操作的注意事项,活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。,细胞的固定化方法,1) 直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶
12、或少数几种酶催化的反应。 2)吸附法 3)包埋法,2. 固定化方法,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。（2）稳定性的增加 。（3）最适温度和最适pH常保持不变。,固定化细胞的特点,固定化酶（细胞）的评价指标（一）,固定化酶（细胞）活力：固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 通常采用间歇测定和连续测定方法。蛋白总量：1）双辛可宁酸法(BCA法) ；2）考马斯亮蓝法 。半衰期：在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示，是衡量稳定性的一项重要指标。,如果耦联率与酶活力回收
13、率相近，则表明固定化方法对酶活力没有明显影响。,固定化酶（细胞）的评价指标（二）,偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100%活力回收率=固定化酶总活力/加入酶的总活力100%相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸乙酰 -D Ala,固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶,2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓：纤溶酶是异源蛋白质，在人体
14、内引起免疫反应，无法长期使用。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,2. 人工肾：原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,三、在分析检测中的应用,Sensitive and specific Rapid Simple,Biosensor,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡
15、萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极。,葡萄糖酶电极,酶电极示意图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,Glucose,Gluconic acid,Glucose oxidase,Oxygen,Hydrogen peroxide,Membrane,Electrode,根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,继酶传感器（enzyme sensor）后，又出现：细胞器传感器（cell organelle sensor）组织传感器（tissue
16、 sensor）微生物传感器（microbe sensor）免疫传感器（immunosensor）,1）酶传感器的原理,生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,生物识别元件(Biological recognition element),是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,换能器(Transducer),将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。,酶传感器工作原理示意图,酶传感器主要由固定化酶膜和变换
17、器组成：固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应；变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,2）酶传感器的应用,水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物。,医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（glucose oxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。,手掌型葡萄糖(glucose)分析仪,SBA-50型单电极生物传感分析仪,SBA-70型血糖乳酸自动分析仪,食品鲜度,鱼鲜度传感器：在日本、加拿大等国广泛用
18、于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内ATP经酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K值表示：K=肌苷+次黄嘌呤/ ATP +ADP+AMP+IMP +肌苷+次黄嘌呤+尿酸大多数鱼死后520h，ATP，ADP和AMP已分解尽，超过24h，鲜度主要取决于IMP-肌苷-次黄嘌呤-尿酸。 将这三个步骤的三种酶（5核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。 当K20时，鱼极新鲜，可供生食。 K在2040之间为新鲜，必须熟食。 K大于40，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。,肉鲜度传感器,肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程
19、度。用腐胺氧化酶与过氧化氢电极构成多胺生物传感器，或用单胺氧化酶膜和氧电极组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。,9. 用心观察成功者，别老是关注失败者。3. 空想会想出很多绝妙的主意，但却办不成任何事情。3. 要跟成功者有同样的结果，就必须采取同样的行动。14、一个能从别人的观念来看事情，能了解别人心灵活动的人，永远不必为自己的前途担心。2. 对于最有能力的领航人风浪总是格外的汹涌。13. 暗恋只是一个人的独角戏，却在心里演了一幕又一幕。就像林夕说的那句话一样：他可能没有做过什么，也可能不小心做多了些什么，却无辜地被你大爱了一场。1. 睡觉是为了踏实工作，工作是为了踏实睡觉。3. 含泪播种
20、的人一定能含笑收获。3、未曾失败的人恐怕也未曾成功过。1、忘掉失败，不过要牢记失败中的教训。10. 狂妄的人有救，自卑的人没有救。13. 因为爱心，流浪的人们才能重返家园;因为爱心，疲惫的灵魂才能活力如初。渴望爱心，如同星光渴望彼此辉映;渴望爱心，如同世纪之歌渴望永远被唱下去。1. 最短的距离是从手到嘴，最长的距离是从说到做。13. 别人可以违背因果，别人可以害我们，打我们，毁谤我们。可是我们不能因此而憎恨别人，为什么?我们一定要保有一颗完整的本性和一颗清净的心。19、任何的限制，都是从自己的内心开始的。18. 生命不是一张永远旋转的唱片;青春也不是一张永远不老的容颜。爱情是一个永恒的故事，从
21、冬说到夏，又从绿说到黄;步履是一个载着命运的轻舟，由南驶向北，又由近驶向远。14. 有两个独立的房间，在各自房间里工作，一起找个地方吃晚饭，散步的时候能够有很多话讲，拥抱的时候在一起的时候觉得安全，不彼此表白，表白是变相的索取，不会太想对方，累的时候，知道他就是家。2. 不是境况造就人，而是人造就境况。14. 磨练，使人难以忍受，使人步履维艰，但它能使强者站得更挺，走得更稳，产生更强的斗志。19. 网络事业创造了富裕，又延续了平等。7. 说一句谎话，要编造十句谎话来弥补，何苦呢?5. 你最大的风险是缺少我们对你的信任。7. 把自己的欲望降到最低点，把自己的理性升华到最高点，就是圣人。9. 岩石下的小草教我们坚强，峭壁上的野百合教我们执著，山顶上的松树教我们拼搏风雨，严寒中的腊梅教我们笑迎冰雪。9. 根本不必回头去看咒骂你的人是谁?如果有一条疯狗咬你一口，难道你也要趴下去反咬他一口吗?2. 即使没有月亮，心中也是一片皎洁。,
