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1、植物数量性状位点（QTL）图位克隆,第五章第四节,数量性状变异的遗传基础,生物自然群体在形态、生理、行为和抗性等性状上存在极大的变异，表现为数量性状遗传。数量性状涉及多个位点，每一位点的效应微小，存在等位基因的变异，等位基因的效应通过每个个体所处的环境表现出来。P=G+E+GE当前生物学的一个重大挑战是明确数量性状变异的遗传基础,数量性状位点 (QTL),Quantitative Trait Locus (QTL)是生物基因组上的某个区段，它含有一个或多个基因，影响数量性状的变异。QTL可以通过多态性分子标记与性状的连锁关系而确定下来，即QTL定位。,QTL初定位 -查找QTL在基因组上的大概
2、位置,初定位的群体：连锁群体和关联群体：连锁群体：人工群体，利用杂交过程中产生的重组，通过分子标记多态性与性状变异的连锁关系定位QTL。关联群体：自然群体，利用进化或育种过程中所积累的重组和变异，通过基因组中的连锁不平衡（LD）来确定遗传多态性与性状变异的关系。缺点：定位结果很大程度上依赖于群体结构和等位基因频率。,连锁群体的基因组结构和QTL初定位,连锁群体：临时性分离群体：自交群体（如F2、F3）和回交群体（BC1、BC2）等。永久性分离群体：重组自交系群体(RIL)和加倍单倍体群体(DH)等。在分离群体基础上筛选的极端个体群体。,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,F2
3、,RIL,表型鉴定以单株或其后代家系为基础，准确性不高，不能重复试验。简单，遗传变异丰富，可以同时估计加性和显性效应。,后代稳定，不发生分离，鉴定性状以纯合株系为基础，准确性高。群体准备周期长，只能估计加性效应。早代多次互交，增加重组。,F2群体QTL初定位,0/2:homozygous genotypes 1: heterozygous genotype,关联群体的基因组结构和QTL初定位,关联群体QTL初定位,Diagram of genome reshuffling between 25 diverse founders and the common parent and the res
4、ulting 5000 immortal genotypes.,Yu J et al. Genetics 2008;178:539-551,连锁-关联群体的基因组结构和QTL初定位,Poland J A et al. PNAS 2011;108:6893-6898,用NAM群体鉴定出了29个QTL，抗性等位基因用红色，感病等位基因用绿色。,公共亲本B73自交系和25个核心自交系的小斑病抗性,QTL精细定位 -确定QTL在基因组上的准确位置,在禾谷类作物中，许多影响重要农艺性状的QTL已被定位，相比较而言，克隆到基因却非常少。一般来讲，初定位的QTL置信区间在10-30cM，包含几百个基因。不清
5、楚QTL是对应一个基因？还是多个紧密连锁的基因? 如果对应有多个基因，基因的效应相同? 还是相反？是否累加? 等等必需精细定位QTL，克隆对应的基因。,QTL是通过统计分析得到的，定位在染色体某一置信区间内。增加分子标记和完善统计分析软件，对置信区间的缩小并不是很有效。精细定位，即在QTL初定位基础上，针对目标区间构建遗传背景一致的次级遗传分离群体，把复杂性状QTL界定于更小的基因组区域内。将QTL作为一个主Mendelian因子来进行精细定位。,QTL精细定位的可行性,QTL精细定位决定于三个基本要素：1) 高密度标记；2) 关键重组个体；3) 重组个体性状的准确鉴定。 目标：QTL-QTG
6、-QTN Locus-Gene-Nucleotide,QTL精细定位三要素,QTL精细定位标记密度,基因组大规模重测序、SNP芯片、比较基因组学等保证在目标基因区域获得高密度的分子标记。禾谷类作物的基因组重测序产生了海量的SNP信息，用于开发目标基因区域的高密度分子标记。玉米的 HapMap 计划 (Gore et al. 2009)有160万SNP。水稻中，Huang et al. (2010) 检测到360万非冗余的SNP位点，平均 9.32 SNPs/kb。,QTL精细定位关键重组个体,成功的QTL精细定位依赖于关键重组个体，也即在目标QTL区域有高频率的染色体交换发生。重组频率在染色体
7、的不同区域变异很大，产生所谓的重组热点和重组冷点区域。如QTL位于重组热点，就易获得关键重组个体；不然就需要很大的分离群体，或连续多代，或组配多个组合等方法筛选。染色体不同区域重组频率的高低与着丝粒位置、染色体结构、亲本在QTL区域的序列差异等均相关。,玉米染色体的重组频率和基因密度分布,K.Fengler et al., in press, Plant Genome,通过控制群体结构和后代测定等手段来消除遗传背景的影响，同时增加重组机会。在目标QTL区间建立高分辨率的分子标记图谱，分析目标QTL与标记的连锁关系。主要采用近等基因系(Near-isogenic lines, NILs) , 染
8、色体片段代换系(chromosome segment substitution lines，CSSLs)或导入系(introgression line, ILs), 及基于重组自交系衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family, HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line, RHL) 。,QTL精细定位性状的准确鉴定,利用单QTL-NIL群体的精细定位。筛选在目标QTL区间具有差异、遗传背景完全一致的QTL近等基因系(near isogenic line，NIL)，配组构建群体，或者筛选在目标区间呈杂合型、遗传背景呈纯合型的单株，自
9、交建立分离群体，通过对分离群体单株或单株自交后代测定，分析表型差异，精细定位目标QTL区间。Advantage: Identical background Disadvantage：Laborious & Long time consumed,QTL精细定位策略单QTL-NIL,QTL1 from P1 is obtained by MAS using P2 as a recurrent parent. The resulting NIL1 has a chromosome segment that includes QTL1, but is otherwise identical to th
10、e P2 genetic background.,染色体片段代换系CSSLs，即在受体(供体)亲本的遗传背景中建立供体(受体)亲本的“基因文库”，代换系覆盖全基因组且相互重叠。由代换系组配的分离群体消除了大部分遗传背景的干扰及QTL之间的互作，可提高QTL定位的效率和精度，从而可进一步缩小QTL区间。,QTL精细定位策略CSSLs,CSSL (Chromosome Segment Substitution Line),基于重组自交系（ RIL）衍生的杂合自交家系(heterogeneous inbred family，HIF)或剩余杂合体(residual heterozygous line,
11、 RHL) 的QTL精细定位。RIL群体是连续自交产生的，随着代数的增加，染色体上的大多数位点逐步纯合，一般到F5代就只有6.25的位点处于杂合状态。在QTL初定位基础上，利用分子标记从RIL群体中筛选目标QTL杂合而背景纯合的RHL自交，构建类似单QTL-NIL群体。从RIL群体中筛选，时间短，花费少，现在较多地用于QTL精细定位。,QTL精细定位策略HIF或RHL,RHL (Residual Heterozygous Line),玉米抗病QTL精细定位中遇到的问题,玉米的抗病大多数属数量性状遗传，优良抗病基因多为稀有基因。因此，分离不同的抗病基因需要组配不同的群体。由于玉米染色体结构复杂性
12、，抗病QTL位点的关键重组个体不易获得。抗病性状在年份、地点间的变异很大，关键重组个体的性状鉴定困难。 现有的QTL精细定位方法不适用,1) Variability in symptom development 2) Difficulty in phenotypic evaluation,Genotype,Environments,Genotype,Environments,Pathogen,Morphological Traits,Disease resistance,基于重组个体后代测定的连续精细定位方法,Recurrent parent,F1,Recurrent parent,MAS,B
13、C2F1,Recurrent parent,BC3F1 Progeny,Recurrent parent,BC3F1 Recombinants,MAS,BCn+1F1 Progeny,BCnF1 Recombinants,Donor parent,Progeny testing and MAS,F2,QTL analysis,BC1,Recurrent parent,Recurrent parent,Progeny testing and MAS,Completion of fine mapping,The sequential QTL fine-mapping procedure,MAS:
14、Marker-assisted selectionProgeny testing: Investigation of both genotype and phenotype for each progeny,R:118,S:132,R:235,S:74,Resistant,R:166,S:139,R:177,S:133,P-value0.001,P-value:0.675,Susceptible,Progeny evaluation to detect a QTL in the donor segment,qHSR1,ProgenyGenotype,progeny Genotype,Witho
15、ut donor region,Without donor region,With donor region,With donor region,47.2%,76.1%,57.1%,54.4%,Numbers of progeny required to detect the QTLs at various R2 values,Backcross generation suitable to start the QTL fine mapping,The advantages of the sequential QTL fine-mapping strategy,To reduce experimental errors caused by both environmental factors and genetic background noise To increase progeny size to reveal the authentic genetic effect of a QTLTo screen new recombinants in each generation to narrow down a QTL,
