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1、发酵饲料生产工艺与应用灵璧县立腾同创农牧科技有限责任公司二0一二年十一月目 录安徽省立腾同创农牧科技有限公司 简介安徽省立腾同创农牧科技有限公司 企业文化安徽省立腾同创农牧科技有限公司的十年发展战略 安徽省立腾同创农牧科技有限公司的第一个发展五年发展计划第一章 发酵饲料生产的菌种及发酵工艺第二章 发酵饲料生产技术第一章 发酵饲料生产的菌种及发酵工艺第一节 概述一、 发酵饲料的定义发酵饲料的定义是：在人为可控制的条件下，以植物性农副产品为主要原料，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料或饲料原
2、料。采用发酵技术生产的动物饲料或饲料原料，其特性主要是：（1）含有大量的活性微生物；（2）多数以厌氧发酵方式进行生产；（3）未经干燥的物料含水量通常在30%以上；（4）物料的酸性物质明显增加，营养组成更合理；（5）生产原料以植物性农副产品为主。也有发酵成品是经过干燥处理的，比较典型的有发酵豆粕和发酵棉粕。在发酵过程中有大量的活性乳酸菌和酵母菌发生的代谢作用，经过干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它们也属于发酵饲料。二、 发酵饲料的概述发酵饲料的生产工艺基本都是以固态发酵的方式进行的，生产菌种以乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌为主，绝大多数采用厌氧或兼性厌氧发酵。发酵物料的含水量为30%50%，发酵时间
3、和温度受环境影响很大，基本不进行人为控制和调节。在实际生产中也有采用好氧发酵方式进行的，生产菌种以霉菌和假丝酵母为主，生产用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酵母菌难以降解的杂粕和胶质蛋白。但是生产设备复杂，物料温度和湿度变化很大，控制及其困难。成品主要是作为饲料蛋白原料的替代物，能降低饲料生产成本，但基本不具备生物学活性和功能。本节主要论述厌氧固态发酵工艺，常规的发酵饲料生产流程如：原料消毒冷却接种培养干燥包装工业化规模的微生物发酵过程基本上都是纯培养过程，原料需要消毒，空气需要过滤等。这些操作都是为了确保在发酵产品生产和储存过程中不受杂菌的侵袭和干扰，但也正是这些常规操作使产品的生产成本居高不下
4、，影响了微生物发酵产品在动物饲养中的大剂量使用。大量试验证明，在不考虑动物饲养成本的前提下，大剂量（在配合饲料中添加5.0%以上）使用高活菌含量的微生物发酵饲料可以明显改善动物的生产性能，提高动物的健康水平，甚至可以进行无抗生素饲养。但是采用传统的生产工艺获得的高活菌产品其生产成本通常都在10元/kg以上，如果以10%的比例使用在配合饲料中，每吨配合饲料的成本至少需要增加800元，这个增加值对传统的畜禽养殖业来说是难以接受的。降低发酵饲料生产成本最直接的方式就是简化生产工艺，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是最耗能的操作过程，是导致生产成本增加的主要步骤，也是导致生产设备投资增加的主要原因。如能简化
5、生产操作工艺步骤，同时又能保证产品质量的安全稳定，就能使发酵饲料的生产和应用具备强大的市场竞争力。第二节 发酵饲料的生产菌种发酵饲料的生产菌种很多，主要有：乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和霉菌。一、 乳 酸 菌目前生产中使用的乳酸菌至少有30多种。按乳酸菌的代谢途径，大致可归纳为四种类型：同型乳酸发酵、专性异型乳酸发酵、兼性乳酸发酵和双歧杆菌异型乳酸发酵。（一） 同型乳酸发酵C6H12O6 2CH3CH(OH)COOH一分子葡萄糖分解成两分子乳酸，整个过程不产气，发酵转化理想，产物最合适，效率最高。典型的生产菌种主要有：德氏乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热乳杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌。（二）
6、专性异型乳酸发酵C6H12O6 CH3CH(OH)COOH+CH3COOH+CO2一分子葡萄糖转化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外还释放一分子二氧化碳。相比同型乳酸发酵，这种发酵的转化效率要低得多，而且还有产气损失。典型的生产菌种主要有:发酵乳杆菌、高加索酸奶杆菌、短乳杆菌、巴氏乳杆菌。（三） 兼性乳酸发酵兼性乳酸发酵能同时进行同型乳酸发酵和异型乳酸发酵，这两种代谢进行的程度和比例取决于菌种的性质和外界培养条件。典型的生产菌种有：植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖杆菌、清酒乳杆菌。（四） 双歧杆菌异型乳酸发酵2C6H12O62CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH比较典型的生产用菌种是动物双歧
7、杆菌。双歧杆菌的培养要求很严格，对厌氧要求极高，目前还很难在实际生产中应用。乳酸菌分布广、种类多，有杆状和球形两大类。有单个、成对和链状排列的，基本上都是厌氧菌或微需氧菌。在饲料青储、发酵开始时就繁殖，到饲料因密封缺氧后仍然能繁殖，只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度却快一些。乳酸菌能分解饲料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高饲料的营养价值和适口性，同时还能抑制大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的生长代谢，使饲料产品能长期保存。在饲料青储和发酵的过程中，同型和异型乳酸发酵同时存在，产物除乳酸外还有少量乙醇和CO2。二、 芽 孢 菌目前在生产中应用的芽孢菌有近十种，以杆菌为主，主要为以下三种：地衣芽
8、孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌。芽孢杆菌能耐受高温，在有氧和无氧条件下都能存活。在营养缺乏、干旱等条件下形成芽孢，在条件适应时又可以重新萌发成营养体。利用芽孢杆菌发酵饲料的目的主要是为了消耗培养体系中残留的氧气，为乳酸菌创造一个厌氧环境。另外，近年来研究还发现，有些芽孢杆菌能产生杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的细菌素（也称抗菌肽），这些抗菌肽有很强的针对性，只对某些类型的微生物细胞有破坏作用，对酵母菌和乳酸菌没有影响。三、 酵 母 菌酵母菌是一类单细胞真菌，形态多种多样，主要有球形、卵形和丝状形（如假丝酵母），以出芽的无性繁殖为主，最适宜生长温度为2535，pH偏酸性（4.06.0）。
9、酵母菌基本上都是兼性厌氧菌，在有氧的条件下迅速增殖，在无氧的情况下进行酒精发酵（EMP）。目前在生产中应用的有20多种，主要为以下三种：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母。啤酒酵母和面包酵母是最常用的酿酒酵母。热带假丝酵母和产朊假丝酵母的生长速度很快，在适宜的温度和营养条件下，它们的世代倍增时间不超过3h，特别适合处理食品加工业产生的废水。酵母菌的个体比乳酸菌大得多，直径通常为26m，体积几乎是乳酸菌的1000倍左右。工业生产中常用的酵母菌主要有酿酒酵母和假丝酵母，酿酒酵母是生产啤酒、白酒等含乙醇类发酵物的重要菌种；假丝酵母主要用于好氧发酵生产动物饲料或者废水处理。四、 霉 菌目前在生产中应
10、用的霉菌有近十种，主要为：米曲霉、黑曲霉、白地霉。一般来说利用霉菌发酵，基本上都是有氧发酵，发酵过程会产生大量的代谢热，生产过程中料曲的温度控制往往是生产成败的关键。霉菌发酵目前采用浅盘发酵，料曲厚度不超过5cm。如果采用厚层发酵，需采用强通风装置，生产能耗很大，从这一点上说，霉菌发酵不适于生产饲料或者饲料原料。目前，实际生产中利用霉菌主要是利用它能合成纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶的特性，利用廉价的粗蛋白原料作为发酵底物，生产高活性的蛋白饲料或者粗酶制剂。五、 选用生产菌种的基本原则（一） 安全性（必须同时符合以下两个要求）（1） 菌体本身不产生有毒有害物质。（2） 不会危害环境固有的生态平衡
11、（主要针对某些基因工程菌）。（二）有效性（能满足一个要求即可）（1） 菌种本身具有很好的生长代谢活力，能有效降解大分子好抗营养因子，合成小肽和有机酸等小分子物质。（2） 能保护和加强动物微生物区系的正平衡。这种功效主要是指能有效维护和提高有益微生物在动物消化道中的数量优势，其可通过两种方式达到：一种方式是利用发酵饲料的生产菌种本身就是从饲养的目标动物的消化道中分离出来的有益菌，通过饲喂高比例的发酵饲料直接提高有益微生物的数量，形成数量优势；另一种方式是利用生产菌种或代谢产物可以选择性地抑制或者杀灭有害微生物，形成有益菌的数量优势。实现第二种途径的方式可以多种多样，比较常用的有：耗尽氧气，降低体
12、系的氧化还原电位；降低环境的pH值；代谢物中含有能选择性杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的抗菌物质等。第三节 发酵饲料生产菌种之间的相互关系目前人类可利用的这些发酵技术基本上都是纯培养技术，而实际上在自然界中很难找出单一微生物存在的生态环境。据已有的微生物研究报道，地球上存在的微生物超过100万种，而人类所分离的纯种累计不超过10万种，做过比较系统研究的不超过1万种。根据目前已有的研究成果，大体可以把微生物之间的关系分为以下几种：中性共生、同住、互惠共生、共生、竞争、拮抗和寄生。一、 中 性 共 生这是指两种或两种以上的微生物同时存在于同一个环境中，但是它们之间没有直接的生态关系，各自生活互
13、不干扰。例如淡水中生长的衣藻和水生细菌。二、 同 住这是指两种微生物同处在一个栖所内，其中一个获益，另一个不受影响。常见的现象是一种微生物产生一种代谢物供另一种微生物作为营养物质，或者产生适合于另外一种微生物生长的环境。发酵饲料生产中比较常见的例子有以下几种：酵母菌能在高浓度的糖液（25%左右）中生长。当糖被酵母菌消耗以后，糖浓度的降低就有利于不耐受高渗透压的微生物（如乳酸菌）的生长。能分泌淀粉酶的微生物（芽孢菌）水解淀粉产生寡糖和单糖，为另外一些只能利用还原性单糖的微生物生长提供营养。还有一种比较特殊的同住微生物，好气性菌可消耗氧气，降低环境的氧化还原电位，使之适合于厌氧微生物的生长。这种同
14、住关系只能产生在开始阶段，在后期就不是同住关系了。这种现象在发酵饲料到生产过程中经常遇到，也是利用微生物组合发酵生产发酵饲料的重要理论基础。三、 互 惠 共 生这是两种微生物互惠互利的现象，比较典型的菌种是阿拉伯糖乳杆菌和粪链球菌的组合。阿拉伯糖乳杆菌不能合成苯丙氨酸，粪链球菌不能合成叶酸。阿拉伯糖乳杆菌不能在缺少苯丙氨酸的培养基上生长，粪链球菌也不能在没有叶酸的培养基上生长。但是把它们组合在一起，却可以共同在没有苯丙氨酸也没有叶酸的培养基上生长，因为它们能相互为对方提供必需的限制性营养物质。这种现象在自然界中普遍存在，发酵饲料的菌种组合应该多考虑这种组合优势。四、 共 生共生是指两种微生物在
15、同一个严酷环境中彼此相依为命。比较典型的例子是地衣，它是蓝细菌（或蓝藻）与真菌共同组成的一个形态和生理单位。蓝藻或蓝细菌的细胞仅限于特定的层内，地衣内的菌丝交织成菌丝组织，形成一个稠密的外皮层。皮层下为蓝藻的细胞层，在下面为菌丝疏松交织的菌髓层。真菌可以从蓝藻获得碳水化合物，真菌菌丝所摄取的水和无机盐又可以提供给蓝藻，因此地衣能耐干旱、潮湿和抗寒冷。这种现象在发酵饲料的生产过程中很难遇到，少有实用的例子。五、 竞 争当两种微生物对某种环境因子有相同要求时，就会发生生存竞争。由于微生物的世代时间比较短，代谢强度大，所以生存竞争往往表现的很激烈。在一个生存环境内，不同的时间会出现不同的优势种。这种
16、优势微生物在某种环境下能最有效地适应当时的环境，而环境条件一旦改变，就可能被另一种微生物代替并发育成新的优势种。目前工业化发酵生产之所以采用纯种培养，其主要原因就是消除其他微生物的竞争。目标代谢物合成能力强的微生物其生长速度往往比较低，至少比同类的野生菌低。野生菌的代谢活动是很“经济的”。如果从生长速度分析，它们的物质和能量的利用效率要远高于生产菌种。但是，由于生产成本的限制，发酵饲料的生产往往不能采用纯种培养，所以微生物之间的生存竞争不可避免。如何巧妙利用微生物之间的生存竞争是研究微生物发酵饲料生产的一个非常重要的课题。从理论上分析，通过控制调节微生物生存环境可以调整物料中微生物的种类和数量
17、分布，从而达到利用微生物有益菌群种群优势发酵饲料的目的，但是到目前为止，有关方面的成熟技术还是很少。六、拮 抗一种微生物可以产生不利于另一种微生物生存的代谢物质，或者通过代谢活动改变生存环境，而这种环境不利于其他周围微生物的生长，这种现象就称为“拮抗”。如：青贮饲料接种的乳酸菌和醋酸菌在发酵过程中，不断降低pH值，结果绝大多数不耐酸的微生物不能生存，甚至趋向死亡。酵母菌在无氧条件下将糖发酵成酒精，当酒精浓度达到一定数值时，其他微生物就不能生存。研究发现拮抗还具有明显选择性，农业部饲料工业中心分离获得的枯草芽孢杆菌MA139能分泌杀灭大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抗菌肽（细菌素），但对自身
18、、酵母菌和乳酸菌的生长代谢基本没有影响，这种拮抗的选择性是发酵饲料研究所希望的。七、寄 生一种微生物生活在另一种微生物体内或体外，依靠摄取寄生细胞的营养进行生长繁殖，并使后者遭受损害甚至死亡，这种现象称之为寄生。这种现象在饲料发酵过程中可能存在，目前在研究中还没有遇到。微生物是发酵饲料的动力来源，研究发酵饲料中微生物的相互关系是获得高质量发酵饲料的必要前提，也是饲料发酵生产的核心。第四节 发酵饲料的生产工艺一、 固态厌氧发酵高活性生物饲料相对于好氧发酵，厌氧发酵的能耗低，微生物代谢产生的热量也要小得多，生产过程往往不需要翻拌散热。另外，发酵产品只要密封得当，即使长期存放也不会腐败变质。目前比较
19、典型的固态厌氧发酵生物饲料的成功例子主要有两种：一种是适合养殖户自产自用的袋装发酵饲料；另一种是属于规模化流水线生产的袋装发酵饲料。它们接种的微生物基本一致，主要有酵母菌、乳酸菌和芽孢杆菌。适合养殖户自产自用的发酵袋是一种普通的密封包装袋，物料接种以后装袋，再将袋口用绳扎紧，物料的含水量为30%40%。开始时，酵母菌消耗袋内残留的氧气进行增殖和呼吸代谢，同时也为乳酸菌创造一个厌氧的生活环境。然后，酵母菌在无氧条件下进行糖酵解，产生酒精和CO2，乳酸菌也同时增殖、代谢，产生有机酸。随着袋内气压的不断增加，不断有CO2带着酒精和有机酸排出袋外，管理饲料的饲养员可以根据排出的酸香味来判定物料发酵的成
20、熟度。有氧发酵阶段：C6H12O6+6O26CO2+6H2O无氧发酵阶段：C6H12O6 2CO2+2C2H5OH(乙醇)在夏季，发酵35d就有明显的酸香味。在冬季，时间需要延长。如果环境温度低于12，发酵就有可能归于失败。酵母在低温下长期代谢低迷，不产生CO2，使得外界的O2长时间与接种的乳酸菌接触，会导致乳酸菌活力大减，甚至死亡。事实证明，如果环境温度适宜，时间控制得当，采用上述袋装式土办法发酵，也可以获得质量很好的微生物发酵饲料，活性乳酸菌的含量能达到108cuf/g以上。将其在生羊配合饲料中添加15%20%，生羊采食量能明显提高，最多能提高10%以上，而且增重速度和健康水平也有显著提高
21、。这种工艺虽然简单，但是受限制的因素很多，质量标准也很难把握，实际推广有一定困难。为了使这种袋装发酵技术进入程序化、工业化应用，发酵饲料的质量能得到有效保证，必须完成以下几个前提：发酵过程不受环境温度限制；产品质量不受存放时间限制，或者保质期能达到三个月以上；产品在储存和运输过程中不受外界空气干扰。农业部饲料工业中心的微生物发酵饲料课题组发明了呼吸膜可移动式固态厌氧发酵饲料（也称袋装发酵饲料）生产技术。这种发酵技术的具体工艺流程如图1-1。发酵原料粉碎机过 渡 仓电 子 秤搅拌机菌种液计量和包装机成品原料接种以后直接进入包装袋中，包装袋上附加一个可以调节气压的硅胶膜。在发酵过程中，微生物会产生
22、CO2等气体，使得袋内的气压大于外界常压。当袋内气压达到某一临界值时，气体通过硅胶膜排到外界。但是外界的气体始终没有机会进入发酵体系，从而也就排除了外界杂菌的干扰。 研制的特定微生物菌种组合能使乳酸菌迅速繁殖，占据数量优势，原料不需要消毒就可以直接用于接种培养。这种工艺很简单，如果以日产30t计算，设备投资不超过40万元，特别适合在我国广大农村推广使用。第三章 发酵饲料生产技术第一节 发酵饲料用乳酸菌的分离筛选乳酸菌是一类最常见的益生菌，生物饲料的发酵生产一般都离不开乳酸菌。乳酸菌种类很多，市场上流行的产品也极多，至少有20多种。大量实验证明，只有动物消化道国有的微生物才能在消化道内定植，外源
23、微生物只能短时间存活在消化道内，不可能长期融合到动物消化道的微生态系统中。筛选发酵饲料的生产菌种，其主体应该来源于最终适用的动物消化道，而乳酸菌细菌是动物消化道内起主要作用的微生物。一、 样品的采集为了获得合适的生产用乳酸菌，样品的采集很重要。适合于实际生产的乳酸菌必须来源于健康动物的消化道，最好是在发生了瘟疫的养殖场而幸存的畜禽。发生瘟疫的养殖场，动物大比例死亡，幸存的畜禽虽少，但是生命力很顽强，是极好的生产菌种采集样本。以下以筛选符合生羊健康养殖需要的生物饲料用乳酸菌为例，叙述样品的采集和乳酸菌的分离。在实验室中对生羊进行攻毒试验，在饲料中不断加大大肠杆菌（实验用E.ColiK88,这是一
24、种常见的攻毒试验用大肠杆菌）的用量，以检验生羊的抵抗力。经过57d的试验，生羊的健康水平越来越差。我们选择其中两头最健康的生羊进行屠宰，在无菌环境中提取它的胃液、小肠液和大肠液，迅速保存在无菌生理盐水（NaCl的浓度为0.9%）中。目标乳酸菌一般都是厌氧菌，为了确保乳酸菌的活力，需要尽可能降低生理盐水的氧化还原电位。最简便的方法是在溶液中加入适量的半胱氨酸，半胱氨酸有巯基（SH），有很好的还原力，可以消除溶液中残余的氧。二、 乳酸菌的分离纯化样品中的目标乳酸菌含量一般都不是很高，而且还污染了其他杂菌。为了提高筛选成功的几率，在样品进行分离纯化以前，可以对样品进行选择性增殖培养，以增加目标乳酸菌
25、的含量。样品的增殖培养比较简单，把经过适当处理的样品接种到适于目标乳酸菌生长的培养基中。比较常用的是牛奶增殖培养液，在无抗生素牛奶中补充6%8%的蔗糖，高温消毒、冷却，然后用氮气或者二氧化碳驱除溶液中残留的空气，再接入适量采集的样品，在3032条件下厌氧培养1024h。如果样品中的目标乳酸菌含量比较低，可以适当延长培养时间。样品经过预增殖培养以后，目标乳酸菌含量明显提高，可以进入下一步分离纯化操作。乳酸菌分离培养基通常采用MRS琼脂培养基，其营养组成与pH如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米浆：10.0mL;司盘80：1ml;磷
26、酸氢二钾：1.0g/L；三水乙酸钠：3.0g/L；柠檬酸三铵：1.0g/L；硫酸镁：0.1g/L；硫酸锰：0.03g/L；琼脂：18.0g/L。pH6.20.2。加热溶解上述各组分，配制成均匀的溶液，分装在厌氧滚管中（每个管中加56mL）。在115消毒杀菌30min。冷却至50左右后，在冰水中滚动滚管，使固体培养基均匀凝固在管壁上。为了指示培养基的氧化还原电位，可以在培养基中加入极少量的刃天青（一种显色剂），浓度0.02%就足够了。在低电位时培养基显蓝色，随氧化还原电位不断上升，培养基的颜色逐步由蓝转为浅蓝、粉红、红色。如果培养基的颜色转成粉红就基本不合格了。同增殖培养过程一样，在MRS分离培
27、养基中加入适量的半胱氨酸可以在一定时间内维持环境的低电位。分离纯化培养基准备好以后，就可以进行目标乳酸菌的分离操作了。在超净工作台上（或者其他无菌环境中），对经过增殖培养的样品进行梯度稀释，稀释液还是用无菌的生理盐水，把稀释后的样品接种到厌氧滚管中，密封（滚管有密封盖）。在3032条件下培养12d。为了提高筛选几率，可以同时做多个稀释梯度样品的培养。如果两天以后不出现理想的菌落，可以再延长培养时间。虽然乳酸菌的最适宜生长温度是3740，但是在分离筛选过程中，培养温度应适当调低，以降低其生长速度，这样菌落之间的差异可以更明晰，也更有利于挑选理想的菌种。经过上述分离操作，我们获得了5株乳酸菌，它们
28、分别是：1.来源于羊胃的格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）;2.来源于十二指肠的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）;3.来源于小肠的屎肠球菌（Enterococcus faecium）;4.来源于空肠的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）;5.来源于结肠的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentium）。三、发酵力和耐酸稳定性分析为了后续生产应用的需要，我们对分离获得的乳酸菌进行发酵力测定和耐酸稳定性试验。发酵力测定比较简单，主要测定其乳酸菌的产量，具体方法如下：接种分离获得的细菌纯种于试管培养液中，303
29、2恒温培养12h，然后再扩大接种到牛奶瓶中，3032恒温培养6h，测定乳酸含量。在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在， 通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质，并加入适当浓度硫酸酸化，钙离子转化成难溶的硫酸钙沉淀，使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。乳酸在铜离子的催化下，与浓硫酸作用生成乙醛，乙醛能与对羟基联苯作用生成在 565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内，乳酸含量与 565 nm 处波长吸光度呈线性关系，因此，可以通过测定 565 nm 处的吸光度来测定乳酸的含量。实验室乳酸含量的测定一、原 理稀乳酸在浓硫酸作用下加热，可以变成乙醛。乙醛与羟基联苯作用可以生成红色的复合
30、物，在565nm条件下比色测定，可以确定乳酸含量。二、试 剂1. 4.0%硫酸铜溶液 将4g无水硫酸铜溶解在水溶液中，定容至100ml。2. 羟基联苯（C6H5C6H4OH）溶液将1g羟基联苯溶解于100ml浓度为0.08mol/L的NaOH溶液中，储存在褐色试剂瓶中。3.乳酸标准液将280mg纯乳酸锂溶于水中，配成250mL溶液，其乳酸浓度为1mg/mL，存放于4冰箱中。在做标准曲线时将溶液稀释10倍，使乳酸含量为100g/mL。在分别取1，2，3，4，5，6mL稀释液，稀释配制成1，2，3，4，5，6g/mL乳酸标准液。4.浓硫酸溶液在比色管中分别加入1mL乳酸标准液和0.05mL硫酸铜溶
31、液，然后加入6mL浓硫酸，放置5min，冷却至20以下。三、标准曲线的制备和乳酸含量的测定在上述比色管中加入0.05mL羟基联苯溶液，混合均匀，在室温下放置68h，过夜。在565nm波长下进行比色测定，绘制标准曲线。（1） 最大吸收波长的确定乳酸发酵液样品显色后，表明，最大吸收波长为 565 nm。图2-1最大吸收波长的确定（2） 最佳显色条件的选择结果表明，氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著，其余因素的作用不显著，最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3，即氢氧化钙 0.05g，20%硫酸铜 0.8 ml，浓硫酸 6 ml，对羟基联苯 0.125 ml，静置时间 15 min，加热显色
32、时间 5 min。（3） 乳酸标准曲线的制备乳酸标准应用液浓度在 1080 g/ml范围内与吸光度值基本呈线性关系，当浓度大于等于 60 g/ml时吸光度值大于 1，考虑到仪器误差的因素，故制备标准曲线时浓度范围取在 15、20、25、30、35、40、45、50 g/ml，得到如图的乳酸标准曲线，求得标准曲线回归方程为A=0.0189C0.0808(A为吸光度值，C为乳酸浓度，n=8)，r=0.9989，在 1550g/ml范围内呈良好线性关系。（图2-2：乳酸标准应用液浓度与吸光度值之间的关系）（图2-3：乳酸标准曲线）本实验对发酵液进行预处理，排除蛋白质和葡萄糖的干扰，使测定结果更接近真
33、实值；优化了显色条件，使测定时操作简便，精确度高，显色稳定，准确度高，适合于发酵液中乳酸含量的测定。耐酸稳定性分析主要是考虑乳酸菌在实际使用过程中过动物胃酸的成活问题。生长育肥羊的胃酸pH比较低，一般的微生物很难在其中存活，这种功能实际上也利于生羊的健康，使它可以在卫生条件比较差的环境中生存。但是这种特性不利于外源有益微生物的存活，外源有益菌必须先通过胃液的考验才能达到其发挥作用的场所（肠道）。所以耐胃酸稳定性也是决定乳酸菌实际使用效果的一个重要指标，具体检验方法如下：取1.0mL活菌数量已知的培养液，在无菌条件下，接种到生长羊、牛的胃液中，在37恒温培养。同时做6个平行，每隔1h取样1次，分
34、析乳酸菌数量的变化。在生长羊胃液中，上述5株菌都体现了很好的稳定性，其存活率都在50%以上（见表2-4）表3-4 各种乳酸细菌在生长羊胃液中的稳定性时间/h123456格氏乳杆菌存活率/%88.282.691.495.8112136罗伊氏乳杆菌存活率/%88.481.371.466.957.246.8屎肠球菌存活率/%86.562.176.371.264.855.6嗜酸乳杆菌存活率/%91.288.684.276.871.364.2发酵乳杆菌存活率/%94.692.891.488.586.384.6本组试验均是在羊消化道中分离获得的乳酸菌都是天然菌，没有经过基因工程改造，属于安全菌株。遗传性能
35、稳定，不会随着传代而发生变异，安全无毒。可以大量应用在牛、羊等饲料中。另有研究提出在模拟的胃酸中（pH值与真实胃液胃酸相同）进行稳定性试验，其结果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的稳定性，其原因是真实胃液中蛋白酶对外来生物活性物质具有极强的分解作用，破坏了相当部分外来多酶蛋白和一些细菌素的活性。这是自然界一种自我保护的功能。第二节 发酵饲料用芽孢杆菌的分离筛选和安全性评价芽孢杆菌也是一类比较常见的发酵饲料生产菌，但是这类菌的应用效果与菌种来源、饲养环境和动物类型都有很大的关系。虽然种类很多，但是真正能体现出稳定的、优良效果的还很少。另外，芽孢杆菌不同于乳酸菌和酿酒酵母（或者啤酒酵母），乳酸菌和酵
36、母菌的安全稳定性一般都很可靠（一些耗氧发酵的丝状酵母除外），但是芽孢杆菌的安全稳定性却一直是行业主管部门关注的重点。芽孢杆菌一般都不是动物消化道内固有菌，它们发挥作用的原因至今还没有统一的定论。但是目前人们对两点原因是比较认可的：产生能杀灭大肠杆菌和沙门氏菌等有害微生物的抗菌肽类物质（或者称为细菌素）；消耗环境中的氧气，为乳酸菌的生长繁殖创造厌氧环境。芽孢杆菌的分离筛选主要也是依据上述两个原则。安全性评价主要依据抗生素敏感性以及致毒性，相关的技术都比较成熟。一、样品的采集和初筛与乳酸菌的分离筛选一样，目标芽孢杆菌也是从发生了瘟疫的动物养殖场或者进行攻毒试验幸存的动物体中筛选。1.样品的采集与初
37、筛在发生了大批死亡的养殖场里，我们从土壤和粪便中采集样品，共需采集24个样品，每个样品约2g，在无菌条件下分别保存在20mL无菌生理盐水中，并用冰块降温，在12h内进行后续的培养分离，具体方法如下：（1）取0.5ml样品液，加入到5ml的复合营养肉汤（MNB）中。MNB培养基组成与pH：葡萄糖：5.0g/L;蛋白胨：5.0g/L；牛肉膏：3.0g/L;酵母浸粉：1.0g/L;MgSO4H2O:0.005g/L。pH:7.00.2把上述组分均匀溶解在水溶液中，在120消毒30min，然后冷却到常温，备用。（2）从24种样品中分离得到芽孢杆菌菌株约120株，这些芽孢杆菌均具有革兰氏阳性、过氧化物酶
38、阳性、产生好氧芽孢的特性，但是仅有6株对E.coliK88具有强烈的抑制作用，它们都基本具备了芽孢杆菌的特性，将此6株菌株编号为：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633和MA744，并将这6株作为后续复筛的备选菌种。二、菌种的复筛在芽孢杆菌的复筛过程中，设计了待筛菌与4种指示菌同步混合培养的方法，这种设计的目的：创造丰富的营养条件便于候选菌株的富集生长；采用指示菌混合培养，给候选的芽孢杆菌营造一个竞争的环境，有利于产生高抗菌活性的芽孢杆菌，并能在有限的环境中为争夺营养条件，拮抗其他细菌而存活下来。同时在不同的试管中分别接种4种指示菌（见表3.5），浓度约为106cfu/mL。表
39、2-5 4种指示菌及其来源指 示 菌学 名来 源金黄色葡萄球菌鼠伤寒沙门氏菌大肠杆菌 K88大肠杆菌 K99Staphylococcus IVDC C56005SalmonellatyphimuriumIVDC C79-13Esherichia coli IVDC C83901Esherichia coli IVDC C83529中国兽医微生物菌种保藏中心中国兽医微生物菌种保藏中心中国兽医微生物菌种保藏中心中国兽医微生物菌种保藏中心在上述4个指示菌中，大肠杆菌K88的抵抗力最强，金黄色葡萄球菌抵抗力最弱。制备指示菌悬液时，用接种针从斜面上挑取少量的指示菌，分别接种到营养肉汤培养基（MNB）中，
40、37培养1824h，保证菌悬液的浓度为108cfu/mL左右。接种菌液后，在37混合震荡培养48h，培养液然后置于70的水浴中保温30min，杀死营养细胞。存活的芽孢经过10倍稀释，取一定的稀释液涂布于MNA固体培养基（在MNB培养液中加入1.8%左右的琼脂）平皿表面，使之形成单菌落。根据菌落形态的差异，挑起产芽孢的、革兰氏阳性的单菌落，接种到试管斜面中，编号后保存在4冰箱中。然后在采用平板扩散的方法，将分离出来的芽孢杆菌用灭菌牙签蘸取少许分别点种到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37下培养24h，除去部分水份以便于抗菌物质在培养基中扩散），37培养24h，然后把平板倒扣于盛一薄层氯仿的培
41、养皿盖上并熏蒸约40min，以便杀死活细胞并能让菌落固定于平板的表面，然后移去培养皿盖并让平板里残余的氯仿挥发30min（以挥发彻底）。在平板表面铺一层刚培养好的指示菌培养液，均匀布满后倾倒出剩余的菌液，晾干平板，置平板于37培养1618h，观察点种的芽孢杆菌周围抗菌圈的大小和清晰程度，来判断受试菌对指示菌的抗菌能力。这6种芽孢杆菌当中，MA139对4株指示菌表现出最强的抗菌能力（见表2-6、图2-7）。表2-6 初分离出6株芽孢杆菌对4株指示菌的抑菌圈直径菌株抑菌圈直径/mmE. coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.80.635.6
42、0.746.80.540.60.8MA13932.01.035.90.747.50.542.50.7MA35728.20.435.00.645.40.840.80.7MA55931.30.933.60.844.41.138.30.9MA63429.60.731.51.245.60.638.61.0MA74431.01.033.60.645.70.838.41.1注：表中值为平均值标准差。图2-7 MA139对指示菌的抑制作用（A、B、C、D分别代表对大肠杆菌K88、K99、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用）三、芽孢杆菌的抗逆性试验与乳酸细菌的耐受性试验一样，芽孢杆菌也需要进行类似的检验
43、。芽孢杆菌必须在胃肠道存活，同时还必须能够经受住小肠液对菌体的破坏作用，也就是要求芽孢能够抵抗小肠液中的胆盐和胰液素对它的毒害作用。分别提取生长羊（体重4060kg）的胃食糜和小肠食糜，分别是用4层无菌医用纱布挤压过滤，取滤液，检验芽孢杆菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量对胃酸的pH有很大影响，食糜量越少，酸度越大。为体现良好的代表性，生羊胃液的样本数可以适当多一些（通常取10份）混合以后在用纱布挤压过滤。经过筛选出来细菌MA139，活化两次后接种于MNB培养基中，37下225r/min震荡培养36h，将培养液置于80水浴保温15min，离心收集芽孢（相对离心力为2500g，5min），菌体用
44、磷酸缓冲液（PBS:0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4,pH7.0）洗涤两次，最后复溶在PBS缓冲液中，即为菌悬液，用于后续的抗逆耐受性试验。从试验的结果发现，在胃液中保持3h，活性芽孢的数量基本没有下降，证明其对胃酸的耐受性很好。在小肠液中，起始24h内不生长，而24h后开始生长，培养液变得浑浊。在试验的第5天，取样染色分析，发现培养液中有大量芽孢增殖。表明MA139在小肠液中开始受到了一定的抑制，但是随着培养时间的延长，能够适应这种环境。表明MA139的芽孢可以在羊小肠中存活并通过营养体增殖。四、芽孢杆菌的鉴定通过上述的分离筛选，我们获得了比较有价值的杆菌MA139，但是
45、这株杆菌还没有经过生理生化鉴定，我们只是从筛选的过程中体现的发酵特性方面初步认为是芽孢杆菌。在投入应用前，我们必须做严格的鉴定。1. 形态学鉴定首先进行形态学鉴定，观察其单菌落的形态，并对活细胞进行革兰氏染色及芽孢染色。MA139的细胞呈直杆状，芽孢椭圆形近中生，孢囊不膨大。在MNA培养基上培养12h，产生黏液，细胞形态为长杆状；24h后菌落圆形，隆起，表面皱褶，不透明，干燥；培养至36h，菌体均以休眠体芽孢的形式存在，菌落呈白色图2-8（1）。在液体静止培养时有菌膜形成。图2-82. 生理生化鉴定形态鉴定结果（图2-8）符合芽孢杆菌的特性，接着进行生理生化鉴定。生理生化鉴定比较复杂，涉及的操
46、作步骤很多。参照常见细菌细菌系统鉴定手册中的方法，对试验菌种进行糖醇发酵试验、需氧性测定、V-P试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、过氧化氢酶试验、柠檬酸盐利用试验、石蕊牛奶试验等。芽孢杆菌鉴定用培养基如下：（1） 糖醇发酵培养基及葡萄糖产气试验 培养基组成：（NH4）2HPO4 1.0g/L;MgSo47H20 0.2g/L；酵母浸膏0.2g/L。配好后加入2%的溴百里香兰指示剂1mL/L，调节pH为7.2，分别加入1%的底物（糖醇或者葡萄糖），按照底物类型分装试管，并将杜兰管口朝下放入试管，115灭菌30min。（2）运动型培养基 琼脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化钠：5.0/g；蛋
47、白胨：10g/L。pH7.07.2。121灭菌15min。（3）V-P试验培养基 蛋白胨：5.0g/L；K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖：5.0g/L。pH7.00.2。2mL/支分装试管，121灭菌15min。（4）耐盐性试验培养基 营养肉汤培养基分别加入2%、5%、7%、10%的NaCl,pH7.07.2。121灭菌15min。（5）石蕊牛奶试验培养基 石蕊乙醇溶液25mL，脱脂牛奶1000mL，4mL/支分装试管，115灭菌15min。（6）柠檬酸盐试验培养基 NaCl:5.0g/L；MgSO47H20:0.2g/L；（NH4）H2PO4：1.0g/L；K2HPO4：1.0g/L；柠檬酸钠：5.
