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1、抗肿瘤药物筛选,抗肿瘤药物筛选,一 细胞筛选,抗肿瘤药物筛选,2,一 细胞筛选抗肿瘤药物筛选2,筛选方法1.四氮唑蓝（MTT）还原法原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值,抗肿瘤药物筛选,3,筛选方法抗肿瘤药物筛选3,应用：用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。特点：灵敏度高、经济。 缺点：产物不溶于水，需被溶解后才能检测。,抗肿瘤药物筛选,4,
2、应用：用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选,步骤：（1）制备单细胞悬液； (2)对细胞进行计数，计数后接种于96孔板，一般每孔细胞数为5000个（可先做细胞倍增试验确定每孔中最佳细胞数）；（3）将培养板放入CO2培养箱，过夜培养；（4）24h后更换培养基，并在每孔细胞中加入不同浓度药物，继续培养；（5）24或48h以后，加入MTT溶液，再培养3-6h,停止培养，弃取培养基,加入DMSO，每孔150ul，轻微震荡混匀；（6）把96孔板放入酶标仪中，490nm测定吸光度。,抗肿瘤药物筛选,5,步骤：抗肿瘤药物筛选5,抗肿瘤药物筛选,6,抗肿瘤药物筛选6,抗肿瘤药物筛选,7,抗肿瘤
3、药物筛选7,CCK-8法,抗肿瘤药物筛选,8,CCK-8法抗肿瘤药物筛选8,2.集落形成法：测定单个细胞的增殖能力原理：单个细胞在体外持续分裂增殖6次以上，其后代所组成的细胞群体，称克隆或集落。一般50个以上细胞，通过计数克隆形成率，定量分析单个细胞的增殖能力。用途：抗癌药物敏感性试验，肿瘤放射生物学试验常用方法：平板克隆形成试验，软琼脂克隆形成试验注意：适合贴壁细胞，细胞要分散均匀，操作要柔和。,抗肿瘤药物筛选,9,2.集落形成法：抗肿瘤药物筛选9,3.台盼蓝排斥试验原理：台盼蓝能使死细胞着色（淡蓝色），而活细胞拒染。 活细胞总数100活细胞率（ ） 活细胞总数死细胞总数注意：简单，最常用。
4、染色时间不宜过长。特点：悬浮细胞较方便，贴壁细胞要进行消化，此步误差大。,抗肿瘤药物筛选,10,3.台盼蓝排斥试验抗肿瘤药物筛选10,二 微生物学筛选方法 (抗肿瘤抗生素),抗肿瘤药物筛选,11,二 微生物学筛选方法抗肿瘤药物筛选11,1.噬菌体法噬菌体：是一类能感染微生物的病毒,抗肿瘤药物筛选,12,1.噬菌体法抗肿瘤药物筛选12,（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素常能抑制噬菌体在细菌细胞内的生长，从而不产生噬菌体颗粒而出现抗噬菌体的现象。（2）溶原性菌诱导法：除烈性噬菌体外，还有一种噬菌体，其基因组直接螯合到细菌染色体DNA，不复制，因其大部分基因功能受到了“阻遏
5、物”阻抑，这种带前噬菌体的菌株称温和性或溶原性菌。但是当“阻遏物”的量由于细胞内或环境因子（物理、化学）而降低时，溶原性就不能维持，前噬菌体开始生长，是细菌裂解，称为诱导作用。一些抗肿瘤抗生素有诱导能力。,抗肿瘤药物筛选,13,（1）抗噬菌体法：干扰DNA代谢的抗生素如放线菌素、博来霉素,2.细菌变种法(1)人工培育变种 如:使细菌模仿肿瘤细胞的某些代谢特点 使细菌对核酸或蛋白合成抑制剂敏感(2)检测突变作用 如:依赖链霉素的菌株,抗肿瘤药物筛选,14,2.细菌变种法抗肿瘤药物筛选14,3.抗代谢法,抗代谢物在无机氮源的合成培养基中显示抗菌作用，而在普通有机氮源的营养培养基中无抗菌作用（因为有
6、机氮源可将具有抗菌作用的物质代谢），利用此特点，选择无机氮源试验有抗菌作用的物质，作为抗代谢的初筛方法。,抗肿瘤药物筛选,15,3.抗代谢法 抗代谢物在无机氮源的合成培养,三 精原细胞法(抗生素和植物药)1.建立依据 B型精原细胞具有高度敏感性2.实验方法及判定 2228g雄性小鼠，药物直接注入睾丸，不同浓度，每一浓度用23只，注射3天，处死动物，睾丸固定，石蜡包埋切片，苏木精伊红染色，显微镜观察。,抗肿瘤药物筛选,16,三 精原细胞法抗肿瘤药物筛选16,四 利用分子靶点筛选1.抑制血管生成的筛选模型体外：血管内皮细胞培养体内：动物眼角膜囊 地鼠颊囊 裸鼠外耳皮下 鸡胚绒毛尿囊膜,抗肿瘤药物筛
7、选,17,四 利用分子靶点筛选抗肿瘤药物筛选17,鸡胚绒毛尿囊膜模型,鸡胚的生物学构造,抗肿瘤药物筛选,18,鸡胚绒毛尿囊膜模型鸡胚的生物学构造尿囊卵黄囊抗肿瘤药物筛选1,抗肿瘤药物筛选,19,抗肿瘤药物筛选19,对照组,低浓度药物实验组,中浓度药物实验组,高浓度药物实验组,抗肿瘤药物筛选,20,对照组低浓度药物实验组中浓度药物实验组高浓度药物实验组抗肿瘤,抗肿瘤药物筛选,21,抗肿瘤药物筛选21,抗肿瘤药物筛选培训课件,2.以端粒酶为靶点的药物筛选端粒：真核细胞染色体末端的特殊结构。功能是维持染色体稳定性。，防止染色体DNA降解，保护染色体结构基因，调节正常细胞生长。 “生命的时钟” “有丝
8、分裂的计数器”端粒酶功能：通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体DNA端粒的长度。端粒酶活性测定方法端粒酶抑制剂,抗肿瘤药物筛选,23,2.以端粒酶为靶点的药物筛选抗肿瘤药物筛选23,3.细胞凋亡通路靶点,抗肿瘤药物筛选,24,3.细胞凋亡通路靶点 抗肿瘤药物筛选24,细胞周期调控靶点 与侵袭相关的靶点 耐药相关的分子靶点 靶点选择原则：特异性、有效性、综合性、个性化,抗肿瘤药物筛选,25,细胞周期调控靶点抗肿瘤药物筛选25,五 动物模型 整体动物实验法是评价一个药物是否有效的最主要方法 整体动物在肿瘤药理学研究中的作用：1.研究新开发药物对肿瘤的防治作用；2.对抗肿瘤药物进行筛选
9、，探索抗肿瘤机理；3.探索药物和目前常规肿瘤治疗方法的综合应用以提高疗效。,抗肿瘤药物筛选,26,五 动物模型抗肿瘤药物筛选26,常用宿主动物： 裸小鼠（“活的试管”）特点：先天无毛，无胸腺，T淋巴细胞功能完全缺失，对异种移植不产生排斥反应。缺点：费用高，饲养条件高，不宜大量繁殖。一般不用于初筛。应用：观察药物对癌细胞逆转作用，抑制增殖及诱导凋亡作用。,抗肿瘤药物筛选,27,常用宿主动物：抗肿瘤药物筛选27,C57BL/6小鼠特点：黑毛，体型小，性情温顺，易饲养，药敏性好，为研究Lewis肺癌首选。应用：药物体内初筛。,抗肿瘤药物筛选,28,C57BL/6小鼠抗肿瘤药物筛选28,模型建立方法,
10、实体瘤建立及评价：1.小块瘤体接种法2.肿瘤细胞悬液接种法3.培养细胞移植法疗效评价：肿瘤抑制率（对照组瘤重给药组瘤重）/对照组瘤重100腹水瘤建立及评价：评价：对照组通常2-3周内死亡，治疗组一般观察50d左右，计算生命延长率。生命延长率（治疗组平均存活天数对照组平均存活天数）/对照组平均存活天数100,抗肿瘤药物筛选,29,模型建立方法实体瘤建立及评价：抗肿瘤药物筛选29,抗肿瘤药物筛选,30,1 3 5 7 9 1,六 基因芯片技术,1.原理 是一种建立在杂交测序基本理论上的全新技术，它利用固定在芯片上的几万至几十万条探针与样品进行杂交，在一步实验中获取大量的信息。,抗肿瘤药物筛选,31
11、,六 基因芯片技术1.原理抗肿瘤药物筛选31,2.基本技术路线,基因的选择与实验设计根据表达谱数据库选择5000-10000个与发育及疾病相关的基因，制备药物筛选芯片。芯片的制备,抗肿瘤药物筛选,32,2.基本技术路线基因的选择与实验设计抗肿瘤药物筛选32,细胞的培养与药物刺激根据目的药物及表达谱芯片数据库中细胞表达谱选择适当的细胞系，用适当计量的药物加入细胞培养液中，不同的时间取样，抽提刺激前后的mRNA。大白鼠饲养与药物刺激用常规方法饲养大白鼠，用适当计量的药物喂养大白鼠，不同的时间取大白鼠的适当器官（根据所筛选的药物而定），抽提刺激前后的mRNA。,抗肿瘤药物筛选,33,细胞的培养与药物刺激抗肿瘤药物筛选33,刺激前后的mRNA的制备即标记芯片杂交及扫描数据分析及生物信息学分析用表达谱数据库及配套软件分析受药物诱导的基因，针对这些基因的功能确定药物的疗效。,抗肿瘤药物筛选,34,刺激前后的mRNA的制备即标记抗肿瘤药物筛选34,基因芯片技术总流程图,抗肿瘤药物筛选,35,基因芯片技术总流程图抗肿瘤药物筛选35,思考题1.抗肿瘤药物筛选主要有哪些方法？2.MTT法原理是什么？3.名词解释：端粒与端粒酶,抗肿瘤药物筛选,36,思考题抗肿瘤药物筛选36,
