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1、天然药物与中药研究前沿,华中科技大学同济药学院张勇慧博士,药品制造业是高投入、高利润、高科技和高风险的行业。由于其利润高，以及人类对自身的健康、保健日益重视，加之随着近年来生物技术和信息技术以及各相关学科的发展，制药业每年都以约16%的速度增长，成为全球经济投资新亮点。,世界各国法律赋予新药的特殊地位使其在一定时期内具有垄断性质，由先导化合物发展而来的新药，往往为药厂带来极其巨大的利润，所以，不断开发新药是各大药厂争取市场份额、扩大利润的重要来源，同时，新药的不断推出，也为人类与疾病作斗争提供了更为精良的武器。在这一争夺战中，寻找新的先导化合物成为新药开发的焦点，被各大药厂视为生命线。,天然药
2、物是新药的主要来源,美国国家癌症研究所科研人员日前发表报告指出，虽然美国的实验室利用先进技术设计新药，但近25年来推出的新药中至少有70取自大自然，天然产品仍然是大部分新药的来源。,2004年药物新发现创24年来最低纪录，只有25种独特的化合物即新的化学药品问世。研究者认为美国医药公司研制的新药品之所以数量匮乏，是因为它们没有把大自然当作药物化合物的主要来源。研究表明，医药公司在寻找下一种良药时，回归大自然也许会产生更佳效果。,常规药物阿司匹林最初就是从柳树中获取的。应用广泛的化疗药物紫杉醇则是从太平洋紫杉树中提取的。,阿司匹林,紫杉醇,治疗结肠癌的标准化疗药物依立替康以及用于治疗卵巢癌和肺癌
3、的拓朴替康都是从原产于中国的喜树中提取的生物碱类似物。,依立替康,拓朴替康,研究人员试图弄清探索大自然是如何激发人的灵感，从而发现已经上市的药物。研究人员说：“如果没有首先看到泰素，化学家永远也不会想到生产泰素。”“大自然的影响仍然无处不在。但你必须细心地寻找(筛选)。”,天然药物是药物的一个重要组成部分，其来自于植物、动物、矿物和微生物，并以植物来源为主，种类繁多。例如，近来号称“生命摇篮”、占地球表面积2/3的海洋中所含的生物资源正在不断的得到开发，出现了许多可喜的苗头。,天然药物之所以能够治病，其物质基础是其中所含的有效成分。然而一种天然药物往往含有结构、性质不尽相同的多种成分。有些成分
4、在相当长的一段历史时期内还难以用合成药物替代；有些生物活性天然化合物是现代合成药物的先导化合物。,从古柯叶中得到的可卡因为先导化合物合成了普鲁卡因等一系列局麻药可算是这方面工作的一个突出典范。,可卡因,普鲁卡因,药物筛选（drug screening），就是应用适当的方法，对可以作为药用的物质就生物活性和药理作用进行检测，根据检测结果，评价某一物质的药用前景，为新药研究提供可靠的实验依据。,现代天然药物筛选技术药物分析与质量控制新技术天然药物的开发中药知识产权保护中药研究的展望,现代天然药物筛选技术,70年代中期,同位素标记和检测方法的建立,特别是闪烁接近分析法(scintillation p
5、roximity assay,SPA)的应用,使药物筛选技术有了极大提高。80年代中期,实验室自动化工作站的应用,使药物筛选工作的工作强度、实验成本和样品需要量降低(10mg)。,随着科学技术的发展，新技术和新方法不断的涌现，促进了药物筛选技术的发展。80年代后，药物筛选由整体动物实验为主转变为体外实验为主,形成了高通量药物筛选(high-throughput screening,HTS)的模式,使大规模高效率的药物筛选工作在世界范围内广泛开展起来。,现代天然药物筛选的基本过程,现代天然药物筛选主要技术形式,药物筛选,对特定样品的筛选,定向筛选,随机筛选,高通量药物筛选,比较筛选,计算机筛选,
6、利用生物信息学筛选,超高通量药物筛选,随机筛选,随机筛选是最经典、最基本的药物筛选方式，它是用一个或多种生物试验手段筛选自然资源或化合物。从原始阶段人类寻找药物到目前对新化合物的各种生物活性测试，实际上都是随机筛选。,现在应用的许多药物就是通过随机筛选得到的(利用细菌培养法筛选抗菌素，利用瘤株细胞培养法筛选抗癌药物)。随机筛选的特点是能够发现全新药物，但机率低。例如美国国家肿瘤研究所(NCI)采用随机筛选，每年筛选10000个化合物，连续9年，只有1个药物上市。,定向筛选,定向合成筛选是指采用特定的方法，专门筛选防治某种疾病的药物。这种筛选主要特点是合成筛选紧密配合，经重复性试验过程，根据构效
7、关系，不断对化合物进行结构修饰，最终找到选择性的候选化合物。定向合成筛选成败的关键在于确定适当的筛选目标和范围，选好靶标(target)和筛选指标。,2O世纪7O年代以后，这种筛选在新药发现研究中占主导地位。8O年代以后，这种筛选方式更强调靶标的选择，提出了基于机制的筛选，即根据疾病发病的分子机制，选择关键靶标，建立相应筛选方法，进行靶向筛选。,据统计，除抗感染、抗病毒和抗寄生虫类药物以外，制药工业用来作为药物靶向筛选的靶标已有417种，包括受体、酶、离子通道等，涉及1O个系统的功能或疾患。人类基因组计划完成后这种靶标可增至3OOO4000个。据统计，人类疾病有3万种，但药物能控制和改善的只有
8、1OO150种。未得到控制和改善的疾病大多数与基因有关，每一种疾病大约涉及51O个基因。,对特定样品的筛选,这种筛选方法的特点在于利用了已有信息，在特定的样品范围内进行筛选。例如抗生素类药物的筛选，就是根据青霉素的来源作为借鉴，以多种细菌的产物作为样品，筛选其抗菌活性，从而发现了大量新的抗生素药物。,我国目前对中药的研究也是采取这种方法，根据中药已有的相关信息，选取对某类疾病可能有效的物质，筛选其有效成分。采用这种方式筛选，具有较高的成功率，但由于筛选范围受到限定，特别是所依据的信息资料不可能都有代表性，也可能产生误导。,比较筛选,这种方法是根据对现有药物的认识，获得结构或性质相似的样品，采用
9、确定的模型进行筛选，由此发现同类型而作用更好的新药物。这种方法主要用于“me too”药的研究，成功率也较高，但是难以产生创新药物。,计算机筛选,计算机筛选又称理性发现，这种筛选的策略是将基于机制的筛选与药物合理设计融为一体。合理性药物发现需要理论计算药物设计化学合成生物筛选密切配合，其关键在于药物设计。成功的合理药物设计可大量减少化学合成和生物筛选的工作量，提高新药发现的机率。,这种方法为改进现有生物活性物质的结构，设计新的药物，提供理论上的先导和思路，从而改变以往新药研究“泛泛合成，普遍筛选”的状况。目前，这种筛选不再是一种纯理论性的方法，它与近年来发展起来的新技术(如组合化学、高效性药物
10、筛选系统等)相结合，极大地加快了药物的研制过程。,高通量药物筛选,高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。,高通量药物筛选技术是20世纪80年代出现的发现新药的技术体系，虽然至今不足20年的历程，但其规模、效率和技术水平已经得到了巨大发展，成为国际新药研究的重要技术。,高通量药物筛选技术概况,高通量药物筛选所采用的筛选方
11、法一般是以药物作用靶点为主要对象的细胞和分子水平的筛选模型。根据样品与靶点结合的表现，判断化合物的生物活性。常用的高通量药物筛选模型的基本原理是判断药物与靶点的结合能力和对靶点功能的影响。,样品与靶点的相互作用,理论基础反向药理学,高通量筛选技术体系的组成,(1)化合物样品库：化合物样品主要有从天然产物中分离纯化和人工合成两个来源。(2)自动化的操作系统：自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。,(3)高灵敏度的检测
12、系统：检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。常采用以下分析方法：a)荧光分析法 均相时间分辨荧光分析法 荧光极化法 时间分辨荧光能量传递分析法 b)微型化放射技术 c)细胞基础的放射性技术,(4)数据库管理系统：四个方面的功能 样品库的管理功能；生物活性信息的管理功能；对高通量药物筛选的服务功能；药物设计与药物发现功能。,高通量筛选模型,常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。,指受体与放射性配体结合模型。以受体为作用靶的筛选方法,包括检测功能反应、第二信使生成和标记配体与受体相互作用等不
13、同类型。,分子模型受体筛选模型,观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物，产物都可以作为检测指标，并由此确定反应速度。典型的酶筛选包括：(1)适当缓冲液中孵化;(2)控制反应速度,如:温度,缓冲液的pH值和酶的浓度等;(3)单时间点数器,需测量产物的增加和底物的减少。,分子模型酶筛选模型,(1)贝类动物毒素的高通量筛选,其作用靶为Na+通道上的蛤蚌毒素结合位点，用放射性配体进行竞争性结合试验考察受试样品。(2)用酵母双杂交的方法高通量筛选干扰N型钙通道3亚单位与1亚单位相互作用的小分子，寻找新型钙通道拮抗剂。,分子模型离子通道模型,观察被筛样品对细胞的作用，但不能反映药物作用的具体途
14、径和靶标，仅反映药物对细胞生长等过程的综合作用。包括：内皮细胞激活；细胞凋亡；抗肿瘤活性；转录调控检测；信号转导通路；细菌蛋白分泌；细菌生长。,细胞水平药物筛选模型,高通量药物筛选问题及展望,优点:反应体积小；自动化；灵敏快速检测；高度特异性。缺点：（1）高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型，因此模型都不能充分反映药物的全面药理作用；（2）用于高通量筛选的模型是有限的和不断发展的，要建立反映机体全部生理机能或药物对整个机体作用的理想模型，也是不现实的。,缺点：（3）可能的化合物数量远远超出HTS 能力,据记载在过去150 年里全世界总共制备了约有4000 万个化合物,可能被制备
15、的化合物为10200个,有可能成为药物的化合物为1013个,显然要对所有化合物进行普筛不现实;（4）HTS 的成本问题,以平均每次筛选5 美元计算,每天筛选100 万次将会耗费500万美元。,上述的问题促使“非理性”HTS 向“聪明的”HTS 发展,遵循筛选/分析周期,即通过有限数量化合物的筛选,对筛选数据进行挖掘,利用统计学方法把化合物结构信息和活性数据联系起来,进行定量构效关系(QSAR)分析,以指导化合物的设计和优化,获得活性和选择性更强及毒性更小的先导化合物。,我们应该相信，随着对高通量筛选研究的不断深入，随着对筛选模型的评价标准、新的药物作用靶点的发现以及筛选模型的新颖性和实用性的统
16、一，高通量筛选技术必将在未来的药物研究中发挥越来越重要的作用。,超高通量筛选,一般将每个工作日检测次数105、反应体积10L、在高密度(1536孔)检测板中进行的药物筛选认为是uHTS。uHTS采用微量化技术、灵敏的信号检测方法、多种板样式、自动化样品传送系统和数据管理系统,因而具有高效、成本效益比合理的特点。微量化技术是实行uHTS的关键。,检测微量化需解决以下几方面问题:(1)液体处理系统的精确性；(2)蒸发效应最小化；(3)检测灵敏度可变；(4)蒸发表面与体积比增强吸附效应；(5)试剂的稳定性、酶反应动力学、细胞沉积和存活水平；(6)完全应用高密度板加样设计。,高度实验室自动化是uHTS
17、的前提条件。带有开放框架的自动化平台可以嵌入不同厂商提供的模块,以满足特殊检测的需要。不同厂家生产仪器的集成存在软件整合的问题。目前,已有不需要物理上进行整合的不同模块构建的完全自动化uHTS系统。,高信息量筛选,经典的HTS 是基于孔的单次检测,得到有限的数据,初筛得到的阳性结果需要进一步确认。而高信息量筛选(high content screening,HCS)是基于个体细胞对细胞表型的多次测量,有更多的生物学信息和多个终点的定量资料,可用于筛选和确认先导化合物。因此,HCS将成为HTS的发展方向。,目前,应用较多的荧光标志物适用于检测细胞器、一氧化氮、活性氧、胞内钙离子、酶底物、荧光共振
18、能量转移和酶偶联等,评价细胞存活、增殖和凋亡。HCS应用于药靶的证实和药物初筛。,传统的以药靶为中心的药物发现过程不十分理想,因为没有充分考虑到药物与机体相互作用的复杂性。在药物筛选中较早应用基于细胞的检测方法会产生高质量的先导化合物,减少开发后期失败率。HCS及多指标HTS都是基于细胞的筛选技术,所以,充分利用这些技术采取检测微量化、动态检测和应用图像生物传感器等方法,从活细胞中获得大量的信息,借助一些分析工具将这些信息转变为认识,加深药物与细胞相互作用的全面认识,以加快新药研究和开发的速度。,基因工程技术,1.重组受体与药物筛选2.转基因动物与药物筛选3.基因探针技术与药物筛选,传统的受体
19、制备是从大量的组织匀浆中提取,生物技术的进步为重组受体技术的产生奠定了基础,它把受体或受体亚型的基因从人体组织中克隆出来,再在微生物或哺乳动物细胞内表达。重组受体与传统的受体制备技术相比,其优点很多:(1)受体是人的而不是动物的，所以用重组受体所得的试验结果与在人体试验的结果直接相关；(2)可大量制备受体,并能得到只在特定组织中存在，用传统制备方法难以获得的受体；(3)用克隆方法可得到纯的受体；,重组受体与药物筛选,(4)重组受体在细胞内或细胞膜上,包含了G2蛋白等信号转导系统,更接近人体的自然状态；(5)重组受体更经济等。重组受体的诸多优点吸引着越来越多的人们用重组受体进行药物筛选的研究。成
20、功的建立起了亲代谢谷氨酸受体、神经肽Y受体、A3肾上腺素受体亚型等多种重组受体并应用于药物筛选。,转基因动物是指用实验方法将外源基因导入染色体基因组内进行稳定整合,并能遗传给后代的一类动物。在医学研究中转基因动物可以“真实”地体现目的基因的活动特征,将分子水平、细胞水平、整体水平的研究有机地联系起来,可在不破坏活体原有系统的前提下,对一个或多个因素进行研究,使问题简化。利用转基因动物可建立敏感动物品系及人类相同疾病的动物模型用于药物筛选,避免了传统的动物模型与人类某种症状相似的疾病在致病原因、机理不尽相同的缺点,其结果准确,经济,试验次数少,大大缩短试验时间,现已成为人们试图进行药物“快速筛选
21、”的一种手段。,转基因动物与药物筛选,转基因动物是当今分子药理学研究的重要手段,是作为疾病模型用于药物筛选的一种重要工具,但仍存在一些问题,如选择的实验动物的种属差异性、性别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基因能否准确地定位于等位基因上等技术问题。另外,建立转基因动物模型需明确疾病的基因遗传背景和克隆表达。现在常用的微量注射法及胚胎干细胞法各有优缺点,因此有人设想,是否能将这两种方法结合起来,产生更多的实验模型,如早老性痴呆、帕金森病等。,所谓基因探针是指能识别特异碱基顺序的有标记的单链DNA(或RNA)分子片段,也可以说是一段被测定的核苷酸顺序互补的带标记的单链核苷酸。将其与被检测
22、的基因中的同源互补序列杂交,从而检测出所要查明的基因称之为基因探针技术。研究发现,红霉素、四环素、利福霉素、两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于多聚乙酰生物合成途经。在同样作用于这一生物合成途径的放线紫红素的生物合成基因族完全搞清后,以act、act等基因片段作为探针,应用DNA-DNA同源杂交技术直接筛选一些产生作用于多聚乙酰途径的新抗生素产生菌的方法亦已建立。,基因探针技术与药物筛选,蛋白质芯片技术,随着人类基因组计划顺利实施，以生命活动的执行者-蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要,并构想和发展了以高度并行性、高通量、微型化和自动化为特点的蛋白质组检测技术-蛋白质芯片技术,被称为横
23、扫生物科学和医学界的一次“迷你”革命。预计蛋白质芯片在药物靶序列鉴定和药物作用机制的研究中潜力巨大。,由于蛋白质比DNA链要复杂得多,更难于在固相支持物表面合成,所以从DNA芯片跨越到蛋白质芯片并不容易,而且定位于固体表面的蛋白质易于改变空间构象,失去生物活性。芯片制作过程中保持蛋白质的生物活性,成为限制蛋白质芯片发展的瓶颈技术。目前,蛋白质芯片可被设计成多种类型,包括玻璃芯片,基质芯片(如:多孔凝胶、PVDF膜等)和微室芯片等。,基因芯片技术是指采用原位合成或显微打印方法，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，形成DNA探针二维阵列，然后与标记的样品进行杂交，并通过对杂交信号的检测获得所
24、需结果。在整个过程中基本由电脑与机器人操作，如探针合成、阵列排布、点样、结果阅读与分析等，全部实现自动化操作，具有高度并行、高通量、微型化、自动化的特点。因此，利用基因芯片技术，可以在显著提高药物筛选、靶基因鉴别和新药测试速度的同时显著降低成本。,基因芯片技术,借助于基因芯片技术，特别是表达谱基因芯片，获得与药物作用相关的基因表达谱资料。结合表达谱基因芯片技术，可以揭示药物作用的靶向基因，获得新的药靶。同时，利用疗效确切的中药，可以达到事半功倍的成效，可直接获得药物作用前后基因表达变化的信息，不仅为一些新基因的功能研究提供了线索，而且为研究中药作用的分子机制提供了一个新的技术平台。,(1)寻找
25、药物作用的靶向基因,中药是一个天然的巨型的化学分子库，它所作用的对象是具有不同结构层次的高度复杂的有机体，其成分的多样化必然导致作用方式和途径的多样化。因此，利用基因技术筛选新的有效成分，不仅仅是为了弥补传统方法的缺陷，更重要的是在中药新药研究领域，建立全新的理念和先进的研究手段，使中药现代化真正进入一个宽广的良性发展的轨道。,发现新的有效成分,在传统中药炮制中就有一些针对有毒成分的具体方法，但是与现代医药理念对药品的安全性要求尚有相当距离。利用基因芯片技术的高通量特性，可以同时对多种成分、多种细胞/组织多种人群进行药效及安全性评价，有利于在短时间内获得指导性资料。,筛检候选药物的毒副反应,药
26、物基因组学,药物基因组学是研究药物对不同个体产生不同作用的遗传基础。根据个体的遗传差异对患者进行分型，进而指导治疗药物的选择/确定，是新药开发领域的重要方向。中医药对疾病“证”的有关理论和实践，实际上就是根据个体遗传基础差异的表征反应，指导治疗方案的选择，其精髓就是药物的个体化治疗。,利用基因芯片技术和生物信息学技术，可以同时对大量人群开展上述研究，进而使其发展为有效的诊断方法，帮助进行个体化治疗，真正实现“对症下药”。利用基因芯片技术可以明确药物的适用人群，避免不适人群使用该药，从而为此类新药的上市和应用提供保障，并可挽回新药开发的巨大成本。同时，根据患者遗传差异设计新药临床试验方案，还可以
27、减少受试人数，降低费用并节省时间，而得到的数据更科学。,基因组学的展望,基于迅猛发展中的基因芯片技术平台形成的现代中药研究，呈现出比较成熟的研究轮廓，从基因组测序、EsTs 测序、药用活性成分生物相关基因研究都融合了功能基因组、蛋白组、化学生物学研究的新方法、新技术，中医药学强调综合疗效、治标治本，标为症状，本为病因，在对一些病因较为明确的疾病研究中，通过生物芯片对药物成份谱与基因表达谱进行综合研究，在克服简单地观测有限个数的差异表达基因的问题后，以系统化的中药基因组学为研究平台，构建中药基因组学，将从根本上改变中药基础研究的现状，将有助于了解特定中药成份的确切治疗靶位和一些天然药物的开发，而
28、随着越来越多中药或复方作用机制的阐明，可望为中药的现代化研究开辟了一条崭新的道路。,化合物样品、检测方法、自动化操作系统和数据处理及分析系统是现代药物筛选的要素。药物筛选的目标是针对较新或新的药靶、以较低成本发现活性强、药代动力学性质优良和毒性轻微的先导化合物。据美国药物研究与制造商协会统计,整个制药业中新药研究和开发占销售收入的12.8%(美国工业平均为3.9%),而其中的75%是因为新药研究和开发的失败,在初筛中被命中的化合物不到5%能进入临床前评价,说明目前的药物筛选技术还有待于改进。,药物分析与质量控制新技术,薄层色谱法,薄层色谱法(TLC)是将供试品溶液点样于薄层板上,经展开,检视所
29、得的色谱图与适宜的对照物按同法所得的色谱图对比，用于药品的鉴别或杂质检查的方法。TLC 是一种快速、灵敏、高效地分离微量物质的方法,是最简单的色谱技术之一,具有操作方便、设备简单、分离效率高、专属性好、分析速度快、色谱参数易调整等特点，在药物分析中应用广泛。,气相色谱法(GC),GC 法具有高效、高灵敏度、样品用量少和分析速度快等优点,GC 主要是对含挥发性的样品进行检测。,高效液相色谱法,高效液相色谱法(HPLC)是20世纪70年代迅速发展起来的一种高效、快速的新型分析分离技术。HPLC是以液体溶剂作为流动相的色谱技术,它是结合经典液相色谱法及气相色谱法的分析分离原理,进一步发展并迅速成长的
30、新型液相色谱法。该法具有高压、高速、高效、高灵敏性等优点。而且与气相色谱法相比,只要求试剂能制成溶液,而不需要气化,因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热不稳定性差、相对分子质量大的有机物,原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析。,HPLC因其独特的优点已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面,已成为天然药物有效成分分离、分析最重要的方法之一。HPLC方法在中国药典1985年版刚规定使用时,只有8个品种规定使用HPLC方法检测,而到1995年版已达到113个品种,2000版药典的应用达到了282次,在药典所有分析方法中它是发展最快的一种分析方法。,固相萃取技术,固相萃取(s
31、olid phase extraction,SPE)是近20年发展起来的一种生物样品预处理技术。随着SPE柱种类、相关装备及技术的发展,SPE已广泛应用于干扰成分多且药物浓度较低的样品分析,是中药及生物样品预处理中具有发展优势的技术之一。SPE具有很少引入外源性杂质、不会产生乳化现象、萃取回收率高、易于自动化、可有效去除样品中的其他杂质、减少有机溶剂的用量等优点。所以适用于对干扰成分多、浓度低、样品量少等的人体生物样品的预处理。,超临界流体萃取技术,是目前国际上较先进的物理萃取技术，也是一种非常好的分离萃取技术。在临界点以上的范围内，物质状态介于气体和液体之间，这个范围内的流体称之为超临界流体
32、。超临界流体萃取在药物分析中的应用形成同时具有GC和HPLC优点的新一代色谱法超临界流体色谱法(SFC)。,它克服了GC有时要作衍生物的缺点，同时超临界流体色谱除了可采用HPLC常用的UV检测器外，还可以使用GC中的FID、MS、IR等通用检测器，大大提高了分析的灵敏度和应用范围，特别是毛细管SFCMS联用为分析热不稳定和高分子化合物提供了重要的分析手段。,手性色谱法（chiralchroLatography）,手性药物对映体的分离和分析技术在药物质量控制、对映体的生物测定和药理作用研究等方面发挥着重要作用。CC法是指利用手性固定相(CSP)或含有手性添加剂(CMPA)的流动相分离、分析立体异
33、构体的色谱法。,高效毛细管电泳(HPCE),HPCE是新型高效分离分析技术。常用的分离模式有:毛细管区带电泳(CZE)、胶束电动毛细管色谱法(MECC)、毛细管凝胶电泳(CGE)、毛细管等电聚焦(CIEF)和毛细管等速电泳(CITP)。HPCE 与HPLC比,具有分析时间短、分离效率高、适应性广、检测限低、自动化程度高、价格便宜等特点。但该方法的实用检测器种类少,常用的紫外检测器灵敏度较低、进样的定量精密度较差,这些缺点限制了现今HPCE在药物分析领域的应用。随着该技术的不断发展,相信在不久的将来HPCE和HPLC一样将成为最广泛的色谱技术之一。,分子生物色谱法(MBC),MBC法是20世纪8
34、0年代中后期逐渐发展起来的生物色谱法(biochromatography)之一，它以具有活性的酶、受体、抗体、传输蛋白等生物大分子为固定相，即基于生物大分子的特异性相互作用分离纯化和测定具有活性的化合物的新兴技术。,高速逆流色谱技术,仪器工作时，互不相容的两相溶剂在绕成线圈的聚四氟乙烯管内具有单向性流体动力平衡性质。当聚四氟乙烯管做高速行星运转时，如用其中一项溶剂作用固定相，则恒流泵可以输出另一相溶剂载着样品穿过固定相。由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在聚四氟乙烯管中移动的速度也不同，因而能使样品中各组分得到分离。,HSCCC分离物质原理模拟图,高速逆流色谱技术具有两大突出优点：1
35、.聚四氟乙烯管中的固定相不需要载体，因而消除了气液色谱中由于载体带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质；2.由于其与一般色谱的分离方式不同，使其特别适用于制备性分离。,近红外光谱技术(NIR),NIR法分析快速、非破坏性、无试剂分析,且能够反映样品的综合信息,测量信号又可以远距离传输和分析,特别是与计算机技术和光导纤维技术相结合。采用NIR透射、散射、漫反射光谱学检测方法,可以不使用化学试剂,不必进行预处理,可直接对颗粒状、固体状、糊状、不透明的样品进行分析。,由于生产和现代科学技术的发展,特别是对复杂分析体系的要求,用单一仪器或技术就很难解决。于是两种甚至更多种分析技术或
36、仪器在线联机以改善分析性能的技术即联用技术就应运而生,应用多种联用技术,可充分利用各检测器的互补性。应用最广泛的有高效液相色谱-核磁共振联用(HPLC-NMR)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、超临界流体萃取技术-毛细管气相色谱联用(SFE-CGC)等技术。随着分析仪器和计算机技术的迅速发展,联用技术正以前所未有的速度发展。,SFE-GC联用技术,超临界流体萃取(SFE)技术是近年来广泛应用的新型分离、提取技术,一般与GC型监测器联用,具有传质速度快、萃取效率高、无毒、经济、操作简便、选择性好等特点。,HPLC-NMR联用技术,HPLCNMR联用技术是一种高效、快速获得混合物中未知化合物结构
37、信息的技术,近年来,它在药物研究中的应用日益广泛。采用HPLC-NMR方法可对杂质含量在9%水平的药物杂质检测,该法简便、快速、准确。并指出在药物杂质检测中,HPLC-MS测定和HPLC-NMR测定都是简便、快速的方法,但HPLC-NMR联用技术中NMR测定不受HPLC分离过程中使用的缓冲盐溶液的限制,并可以提供大量的结构信息。,在体内药物代谢研究、临床药物检测和生物大分子测定有着广泛的用途。微柱液相色谱的研究也十分活跃,由于分析所需的样品量及流动相的消耗大大下降,检测的灵敏度又大大提高,使HPLC 分析更加灵敏准确、简便快速。特别是联用技术的发展,使之在药物分析生命科学领域的应用更具重要意义
38、。,HPLC-MS联用,GC-MS联用技术,GC-MS是色谱联用中应用最多、最成熟的一种方法。GC-MS用于中药复方制剂鉴别,与传统薄层色谱、气相色谱相比,样品处理简单快捷,灵敏度高,重复性好,因其自身可对成分进行定性分析,所以无需大量的对照品，这对中药复方制剂多组分的同时鉴别具有极大的便利。GC-MS不仅可定性,其中药材特征或主要成分的相对含量保持稳定能更有效控制药物成品质量。,色谱-色谱联用法,气相色谱-气相色谱（GC-GC）联用法、高效液相色谱-气相色谱（HPLC-GC）联用法、高效液相色谱-高效液相色谱（HPLC-HPLC）联用法等。其中HPLC-HPLC联用法亦称柱切换技术，它是由切
39、换阀改变流动相的流向把色谱柱的部分流出液切换到另一根色谱柱上，以实现样品的净化、痕量组分的富集、在线衍生化等目的，在复杂样品的分离、分析中发挥着重要作用。,流动注射分析法(FIA),将一定体积的样品注入到一个密闭的、有适当的液体(反应试剂或水)组成的连续流动的载液中，同时与载液中某些试剂发生反应或进行渗析、萃取，生成某种含检测的物质，流经检测器，产生响应，从而测定待测样品的含量。,热分析技术,热分析技术是研究物质在加热或冷却过程中产生某些物理变化和化学变化的技术。热分析技术在药物分析领域也广泛应用,如化学药品的鉴别、理化常数测定、纯度考查、稳定性考察以及近年来对中药活性成分的研究、中药材真伪品
40、的鉴别、中药制剂质量分析等。目前,一些发达国家已把热分析方法作为控制药品质量的主要方法之一,美国药典23版与英国药典1993 年版均已收载了热分析方法。,天然药物的开发,中药、天然药物注册分类,1、未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效成分及其制剂。2、新发现的药材及其制剂。3、新的中药材代用品。4、药材新的药用部位及其制剂。5、未在国内上市销售的从植物、动物、矿物等物质中提取的有效部位及其制剂。6、未在国内上市销售的中药、天然药物复方制剂。7、改变国内已上市销售中药、天然药物给药途径的制剂。8、改变国内已上市销售中药、天然药物剂型的制剂。9、已有国家标准的中药、天然药物。,选
41、择确定作为开发对象的目标化合物,工业化探讨（大量制备）,临床试验用样品,上市销售（GSP）继续监视安全性、药效,创新药物研究将会重在源头研究阶段,合成,情报,提取、结 构测定,活性筛选,药理 生化,特殊毒性 毒 性,药效药理,一般药理,药物动态,吸收排泄,代谢,作用机理,急性毒性,亚急性毒性,慢性毒性,致畸,致癌,致瘾,生殖毒性,理化学性质、制定质量标准,稳定性,配伍变化,试验方法,试验规格,工业制备方法探讨 合成提取精制 发酵,制剂化探讨,III期：安全性、药效（多数病人，多点观察）II期：安全性、药效（少数病人）I期：安全性（健康人群）申请临床试验(GCP）,申请生产许可(GMP),创新药
42、物源头研究阶段,(GLP),杂志公开发表 接受公众检验,申请专利,中药、天然药物、海洋生物、微生物,“洋中药”是国外从中国进口初始中药材，按照西药的标准，提高中药（复方或单味药）的科技含量，探明中药有效成分，严格进行质量控制，给中药量化标化，阐明中药药理，临床疗效肯定，提高中药制剂质量，做到服用方便。日本的救心丸、韩国的牛黄清心丸、德国的银杏叶制剂均是开发成功的例子，即国内所说的“中药西作”。,复方丹参滴丸是天津天士力集团有限公司研究的新药。1993年获得国家新药证书和生产文号。在原国家科委的支持下，1997年12月9日该药正式通过美国FDA的新药临床研究审评(即IND审评)，并直接进入、期临
43、床试验。,组方简单:只有3味药，即丹参、三七、冰片。疗效肯定:药效实验表明该药有扩张冠状动脉血管，增加冠脉流量，舒张血管平滑肌，降低心肌耗养量防治心肌缺血，抗血小板表面活性和聚集作用。并且有显著的抑制脂质过氧化和抗氧化损伤，消除氧自由基及使SOD活力增加，降血脂和抗衰老的作用。经中国人民解放军总医院、天津中医学院附属医院、北京军区总医院等1000余病例临床验证证明：该药具有疗效高、作用迅速、服用方便、胃肠刺激小等特点，可用于冠心病心绞痛的预防和急救。剂型先进、易接受:滴丸舌下含服与片剂相比,体积小，起效快，易于携带。制剂工艺先进:滴丸中丹参是用现代技术提取，其主要有效成分为水溶性丹参素，而不象
44、一般片剂中是用乙醇提取丹参得酯溶主要成分丹参酮类。三七是用水提取其中的三七总皂甙，而不象片剂中三七是用原药材研西粉末。冰片量也较片剂大为降低，可减轻胃肠道不适的作用方中单位中药的化学成分基本清楚，无有毒成分，易于进行质量控制和稳定性研究。,复方丹参滴丸特点,天然药物中开发新药途径,一、经验积累,中药的研究离不开祖国医学长期实践所积累的经验，是寻找新药的极为重要的源泉和基础。古代，人类在寻找新药的漫长历史中，在亲身“尝试”中不断积累各种药物知识，即神农尝百草的方法。在天然药物的研究过程中，要注重经典文献的调研，如根据中医经验和历代医书上记载中药青蒿对“截疟”有效。东晋葛洪著肘后备急方中记载，“青
45、蒿一握，水二升渍，绞取汁尽服之”，说明青蒿中含有抗疟有效成分，且加热易破坏，故将青蒿低温提取获得抗疟有效成分青蒿素，用于抗疟具有显著的特点，又通过构效关系研究合成了新的衍生物，疗效显著提高，且水溶解性更强。文献是前人积累的宝贵经验，通过查阅文献了解近缘植物的研究概况。只有了解前人成功的经验方法，才能最大限度的借鉴和利用前人的经验开展新的研究，少走弯路，节省人力、物力和时间。,二、偶然发现,偶然发现在新药研究和发现中是较常见的，最典型的例子是青霉素的发现，1928年，英国细菌学家弗莱明一次在研究葡萄球菌的实验中偶然发现那次培养的细菌有些菌落没有生长，仔细观察发现，在这次实验中，培养基被霉菌污染所
46、致，后来从这种霉菌中发现了能杀灭细菌的物质青霉素，开辟了抗生素治疗疾病的新领域。,三、药物普筛,本世纪初，特别是30年代以来，世界各国开展了在特定药理模型的基础上筛选药物的工作，对天然药物的筛选，导致了许多新药的发现。药物的筛选有两种方法：1分离纯化得到纯品化合物，然后再进行活性测试。优点：(1)目标清楚，方法简捷，指标明确，标准同一。(2)分得标准品后可进行多种药理活性的测试。缺点：(1)如果选择的分离方法不当，活性化合物丢失的可能性极大。(2)对于极微量活性化合物，这种方法很容易漏检。,2.在活性筛选方法的指导下进行化合物的分离提取。在供试样品的活性确定以后，选用简易、灵敏、可靠的活性测试
47、方法作指导；在分离的每一阶段对分离所得的各个组分进行活性定量研究和评价，跟踪其中活性的部分。缺点：(1)活性测试的样品及工作量均大大增加；(2)要求分离工作者与活性测试人员两个方面的配合。优点：(1)由于分离过程中，没有化合物类型的框框限制，只以活性为指标进行追踪，故发现新化合物的可能性很大。(2)如果分离过程的某一阶段，如因分离方法或材料选择不当，导致活性化合物的分解变化或流散时，还能迅速查明原因，并可采取相应的措施进行补救。对天然活性化合物的分离来说，这是一种较好的方法。,抑制前列腺素合成酶的药物筛选,追踪分离天然活性化合物时注意事项,1关键在于选择、建立先进的生物活性测试方法,天然活性化
48、合物的追踪分离能否取得成功，关键在于有无好的生物活性测试体系试验模型可以有整体动物、器官、组织、细胞、酶或受体以及体内生物活性物质等。近来并已开始注意在基因调控水平上建立起新的筛选体系。无疑，采用整体动物进行的试验与人比较相近，但是实验费时费钱，现象复杂，加以动物个体差异以及病理模型难于建立等因素，作为指导分离过程的活性筛选方法不太适宜。目前在实际工作中多采用的是那些灵敏、简便、可用于微量样品的体外活性测试方法。其中，利用对酶、受体或体内生物活性物质的抑制或促进作用，以及利用基因调控影响进行的活性测试方法因为简便易行又可定量，更是受到青睐，得到越来越广泛的应用。但是有时这种体外活性测试方法所得
49、结果与药物实际在体内的作用并不平行，故实践中也应予以注意。,2确保供试材料具有活性,美国国立癌症研究中心筛选抗肿瘤活性植物或动物粗提取物方法,3.在众多生物活性中力求找出最本质的作用,天然药物或中药在临床治疗上可能作用于多个靶点，因而具有多种疗效，即表现出多方面的活性。研究者应当力求找出其中最本质的作用，选择建立反映临床治疗作用特点、且效果与之平行的活性测试体系，才有可能追踪分离出目的活性成分或甚至有效成分。,4.注意正确比较并判断各个馏分的活性,分离过程中总是按“等剂量不等强度原则”对每一阶段得到的馏分进行活性定量评估，并与母体作比较，追踪活性最强馏分。一般，如与母体比较，所得几个子体活性强
50、弱参差不齐，则示活性分离与物质分离平行，预示可能得到良好的分离效果；如某个子体活性显著增强，则示分离过程中可能除去了某种拮抗作用物质；如果所得各个子体活性均明显减弱，则提示活性成分可能分解、流散、或因吸附剂发生不可逆吸附所致，或因该药的活性原本为多组分的综合作用(相加或相乘)，故分离后反而导致活性的减弱或丧失。具体问题宜作具体分析，并在查明原因后采取相应对策处理。分离过程中常配合采用各种分离手段以求获得良好的分离效果，并应尽量避免采用可能导致活性成分分解或不可逆吸附的方法或试剂。,四、代谢研究,(1)药物的代谢研究结果又往往给新药研究提供信息。由于药物的体内过程不同，有些药物转化后，活性更高，
