克隆基因的检测与鉴定课件.ppt

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1、基因工程原理纲要,第一讲 基因工程概论属实第二讲 基因工程的主要技术第三讲 基因工程的酶学基础第四讲 基因克隆的载体与受体第五讲 目的基因的克隆与分离第六讲 克隆基因的检测与鉴定第七讲 克隆基因的表达与产物纯化第八讲 基因表达的调控,1,第六讲 克隆基因的检测与鉴定,载体表型选择法,根据插入基因的表型选择,DNA电泳检测法,核酸杂交检测法,免疫化学检测法,转译筛选法,2022/12/29,2,一、抗药性标记及其插入失活选择法,BR322质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位点BamH I和Sal I; Ampr上有插入位点Pst I。,第一节 载体表型选择法,1

2、. 原理：,3,pBR322,2022/12/29,4,（1）四环素：,（2）氨苄青霉素抗性基因：,2. pBR322抗菌素标记选择,产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（3）环丝氨酸：,5,3. 选择过程：,如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（1）四

3、环素抗性插入失活,6,无环丝氨酸培养基,7,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。,8,二、-半乳糖苷酶显色反应选择法,-半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,X-gal,半乳糖,5-溴-4-氯靛蓝,+,+,深蓝色,1. 原理：,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。,9,假阳性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码

4、；（不破坏肽）。,2. 选择过程,10,-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。,2022/12/29,11,利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,一、原理：,第二节 根据插入基因的表型选择,1.弥补缺陷,his-,his+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,12,小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含DHFR的克隆才能生长,例：,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,2. 增加新性状,13,利用有插入片段的

5、重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,一、直接电泳检测法,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,第三节 DNA电泳检测法,分子量 Marker,载体,重组克隆,14,二、酶切电泳筛选法,1. 原理：,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,15,A,B,A或B,2022/12/29,16,2022/12/29,17,不同克隆的酶切结果,2022/12/29,18,筛选过程,2022/12/29,19,三、PCR扩增检测法,

6、1. 原理,PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。,2. 过程,（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。,（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。,（3）电泳PCR产物。,（4）检查是否有PCR产物。,（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。,20,1. 核酸杂交,第四节 核酸杂交检测法,一、原理：,重组克隆与探针杂交。,3. 识别标记,32P 或 125I 。,（1）放射性同位素,2. 检测用的探针,与外源DNA插入片断互补的序列。,（2）非放射性标记,荧光素,21,二、核酸杂交检测方法,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,1. Southern blotting,从宿主细胞中提

7、取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。,只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,22,酶切前,酶切后,插入片断,载体,2022/12/29,23,Southern blot 筛选结果,24,（1）原位杂交筛选,特点：,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,25,26,（2）R-环检测法,DNA-RNA杂交。,1）原理：,2）选择过程,在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。,用外源基因的mRNA与重组载体杂交。,27,缺点：需要电镜！,28,2. Northern blot

8、ting,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,主要检测插入片断是否被转录。,从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交。,29,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,第五节 免疫化学检测法,1. 抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,30,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,

9、二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,一抗,一抗,31,2. 放射性抗体检测法过程,32,3. Broome-Gilbert双位点检测法,质粒基因A,插入基因B,表达,质粒蛋白A,外源蛋白B,融合蛋白,检测融合蛋白。,既检测外源基因产物又检测载体基因产物。,33,固相支 持滤膜,抗A抗体,125I标记的 抗B抗体,质粒蛋白A,外源蛋白B,质粒蛋白A,外源蛋白B,固相支 持滤膜,抗A抗体,发光，底片曝光,34,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1. 原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌

10、型产物。,2. 方法,35,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,36,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1. 原理：,一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。 二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。 酶连（conjugation）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,37,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白

11、,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,38,2. ELISA检测的一般步骤,（1）固定样品,将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，吸附后就被固定在孔底。,孔底,39,加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。,（2）一抗结合,一抗,40,加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。,二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。,（3）二抗结合,二抗,41,加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。,（4）显色反应,42,43,在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。,（5）比色,44,3.EL

12、ISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,45,临床检验常用的单抗,2022/12/29,46,么么么么方面,Sds绝对是假的,四、免疫印迹（western blotting）法,1.原理：,在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。,（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。, SDS:,（SDS-PAGE）：,48, 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：,（Polyacrylamide g

13、el electrophoresis）,在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。,电泳buffer,电泳buffer,49,点样,电泳方向,50,蛋白质电泳的分子量标准,已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。,商品化供应,Da,道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为61023道尔顿,51,Dalton,SDS PAGE,52,凝胶中的蛋白质染色：,考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1g/带，但可褪色回收。,硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5

14、ng/带。,2）转到膜上进行染色。,1）直接染色,53,直接染色电泳结果,2022/12/29,54,68,43,29,18,KDa,A BM 1 2 3 4 5 1 2 3,55,（2）Western blotting,电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。, Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,56,Western装置,57, Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物， 并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根

15、过氧化物酶：HRPO,58,2022/12/29,59,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。, Blotting过程,Immuno Blotting,60, 结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,61,一、无细胞翻译系统,第六节 转译筛选法,能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转

16、录，来筛选其产物是否符合预期。,适用于mRNA转录丰度高的外源基因。,62,二、转译筛选,mRNA,无细胞翻译系统,35S标记的 甲硫氨酸,翻译,35S标记的肽链,PAGE电泳,放射自显影,比较放射性 带纹的位置,载体+外源DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,63,三、杂交抑制转译法,mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。,单链mRNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,能翻译,mRNA,DNA,核糖体 小亚基,核糖体 大亚基,不能翻译,1. 原理,64,2. 过程,2022/12/29,65,四、杂交释放转译法,1. 原理：,在高甲酰胺溶液

17、中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外翻译。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫原性等）。,66,2. 过程,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,总mRNA,cDNA基因的 mRNA,杂交,洗脱,cDNA基因的 mRNA,体外翻译,cDNA编码的蛋白,电泳,凝胶放射自显影,cDNA编 码的蛋白,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,硝酸纤 维素滤膜,载体和插 入的cDNA,收集,35S标记的氨基酸,67,专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DN

18、A序列,放射性标记,待测蛋白质,硝 酸 纤 维 素 滤 膜,能与蛋白质结 合的DNA序列,放射性标记,五、DNA-蛋白质相互作用筛选法,68,一般克隆与筛选策略,69,第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）,一、哺乳动物基因转移的选择标记,1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）,（1）TK选择原理,四氢叶酸的必要性,DHFR,70,氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用,氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸

19、还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成：,71,胸苷酸激酶的补救作用,TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。,T,tk,次黄嘌呤的补救作用,细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。,72, HAT培养基：,Tk- 细胞株。,TK基因。, 宿主细胞, 载体标记,（2）TK选择过程,含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）,只有转入TK基因的细胞才能生存。,73,2022/12/29,74,真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。,2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR）,（

20、1） 选择原理,二氢叶酸还原酶的必要性,dUMP,dATP,TTP,dCTP,四氢叶酸,四氢叶酸,75,DHFR+细胞,二氢叶酸,四氢叶酸,二氢叶酸还原酶,二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸,DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。,能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存,不需要补救！,76,DHFR- 细胞,DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。,不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。,需要补救！,77, 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救,dUMP,dATP,TTP,dATP,次黄嘌呤,补救,胸苷,补救,无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时，,胸腺嘧啶和次黄嘌呤分

21、别补救:,78,DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。, 宿主细胞,（2）选择过程,透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。, 无核苷酸的培养基,需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！,79, 氨甲喋呤“加压”,添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。,DHFR+基因。, 载体标记,只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。,DHFR-,DHFR-,DHFR+,DHFR+,live,die,无核苷酸的培养基,80,是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。,3. 新霉素抗性基因（neor）,（1）选择原理, 新霉素（neomycin）,新

22、霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。, G418（geneticin）,81, 新霉素抗性基因-neor,细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。,G418,真核细胞,死亡,G418,存活,neor,真核细胞,82,含致死剂量G418的完全培养基。, G418培养基,真核细胞株均可。,neor基因。,宿主细胞,载体标记,（2）选择过程,G418：（100-800g/mL）,83,CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活。,氯霉素,cat,含氯霉素的完全培养基。,真核细胞株均可。,cat基因。,乙酰氯霉素,4.

23、 氯霉素乙酰转移酶（CAT）,（1）选择原理,（2） 选择条件,（3） 宿主细胞,（4）载体标记,chloramphenicol acetyl transferase,84,在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素。,（5） CAT分析方法, 免疫学检查：,用抗CAT的血清进行Western blot或ELISA，检查CAT的表达。,Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Mole

24、cular Biochemicals and Molecular Probes., 分析乙酰氯霉素,85,二、植物转化体报告基因筛选法,（1）大肠杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，GUS）； （2）细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）； （3）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因 （Green Fluorescent Protein）。,1. 报告基因（reporter gene),（4）其它,86,2. 几种报告基因的作用原理,4-甲-D-葡糖醛酸,荧光产物,GUS,GFP,紫外光照,发绿色荧光,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸,蓝色水解产物,GUS,87,Fireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP,2022/12/29,88,转入萤火虫的luciferase的烟草,89,烟草叶片表达B型肝炎抗原,90,植物细胞中适用的报道基因,91,92,2022/12/29,93,