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1、western blot 点杂交实验关于一抗二抗验证问题 请问各位，我怀疑我的一抗二抗出问题了，如何验证啊？之前有位前辈说是用一个确定有用的二抗来验证我的一抗，直接把一抗加在膜上，再加新的二抗，然后显影。请容许我问个很傻的问题，那之前还要跑电泳和转膜然后再加一抗和二抗么？还是不需要跑蛋白质，直接用一个新的膜然后加一抗二抗？请大家不要笑话我哈。还有就是国产的抗体效价一般比较低的话，一般什么比例比较合适一点，我用的是*的抗体 hustwb 不用跑电泳！ 其实做个DOT 实验就可以验证到底问题出在哪里，因为不外乎就是可能出在三步上：1）一抗没和目的蛋白结合 2）二抗没和一抗结合 3）显色步骤有问题。
2、 将目的蛋白，一抗，二抗少量 分别点在三小块NC膜上，为 A，B，C；然后用封闭液封闭；A 膜与含适当滴度的 一抗溶液进行杂交1 小时，PBS 润洗；A、B 膜同时与含适当滴度的二抗溶液杂交，同样二抗也使用说明书上推荐的最大量，确保足够结合，PBS 润洗；A，B，C 膜 与 DAB 溶液 作用，DAB 也使用说明书上推荐的最大用量。 然后观察颜色反应，就知道是哪一步出现问题了。 C 没有颜色，则是 二抗和DAB 作用时出现了问题；C 有颜色，而B无颜色，则是二抗和一抗作用时出现问题；C 有颜色，B 有颜色 ，而A 无颜色，则是一抗和目的蛋白不能结合上。 以上的方法是一位高人指点的，我们也曾这样
3、做过，效果不错！ 滴到膜上后要静置35min，使膜将蛋白充分吸附后再封闭，最后洗的时候一般35min就行，没问题的，另外其实c不用封闭和洗膜，直接加DAB显色即可 Dot blot其实和Western Blot转膜后进行的操作步骤都是一样的，要封闭，然后加抗体，最后显影。 1.Dot blot点的样品用做SDS-PAGE的样品即可，蛋白须经变性处理。点样1-5ul即可。 2.摸抗体浓度，也要先将一抗点膜，再封闭，然后加二抗吧，如果先将膜封闭了，那抗体点上了，估计也很难与膜结合吧 3.两种膜都可以，膜干的时候点样。 4.我们一般37度放40min左右，就干了，干了以后斑点的颜色淡一点，和湿的斑点不一样的，自己做过就知道了。膜干后直接封闭即可。
