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1、第八章 重组体的筛选检测,一、核酸分子的遗传学与物理检测法 二、免疫化学与核酸序列分析法,将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组DNA的转化子，这是基因工程的目的所在。,转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。,重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定。,重组子的筛选,直接筛选,间接筛选,DNA鉴定,载体筛选,翻译产物,转录产物,其他方法,（报告基因等）,Northern blotting,Western blotting,标记补救筛选,质粒载体的互补筛选（蓝
2、白色斑筛选法）,噬菌体包装容量的正性筛选,质粒载体的抗性标记筛选,同源性分析鉴定（原位杂交）,DNA序列分析,重组子酶切图谱鉴定,重组子大小鉴定,一、遗传学检测法,1、根据载体表型特征的筛选,（1）抗药性标记插入失活筛选法,第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法,克隆Kan抗性基因,（2）-半乳糖苷酶显色反应筛选法,蓝白菌落,蓝白菌落,筛选白色菌落,2、根据插入基因遗传性状的筛选,重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。,合成某一aa的基因,载体,酶切
3、,连接,重组,缺少该aa合成酶基因的菌株,转化,只缺少该aa的基本培养基,筛选,重组子,生长、获得,二、核酸分子的物理检测法,原理：碱基配对杂交双方：待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针,核酸杂交方法：菌落印迹原位（in situ）杂交 斑点（dot）印迹杂交 Southern印迹杂交 都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。,1、菌落印迹原位杂交,将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能
4、准确反映组织细胞的相互关系及功能状态,实验步骤,Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交200,肺腺癌-cat mRNA 原位杂交法400,2、斑点印迹杂交,斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 常用于病毒核酸的定量检测,RNA或DNA 变性 NC膜固定 杂交 放射自显影 检测,实验原理与步骤,提取,碱溶液,点样,加热,放射性探针,一定条件,X-底片,显影、定影,标记斑点,3、Southern 印迹杂交,1975年，英国Southern创建 DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、转印
5、到固相支持物上，用探针进行检测的方法。,带有DNA片段的凝胶,实验步骤,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,用于分析混合DNA样品中是否存在能与特定探针杂交的序列。Southern杂交由于滤膜是从凝胶上原位印迹而来，因而能够显示出与探针杂交的DNA片段的大小。,用 途,Southern杂交定位kan抗性基因,4、直接凝胶电泳检测法,利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,分子量 Marker,载体,重组克隆,实验步骤,bp1534 994 695 515 377 237,A B C M,
6、5、酶切电泳筛选法,原 理,根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）,用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果。,A,B,A或B,不同克隆的酶切结果,筛选过程,第二节 免疫化学与核酸分析法,利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：,一、放射性抗体检测法,1.抗体与产物的结合方式,对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二 抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,
7、一抗,125I标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,125I 标记的二抗 结合蛋白,125I标记的二抗,2.放射性抗体检测法过程,二、免疫沉淀检测法,把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,1.原理,抗原抗体凝集反应。,检测分泌型产物。,2.方法,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,三、酶联免疫吸附测定（ELISA）,Enzyme-linked immunosorbant assay,1.原理：,一抗（prima
8、ry antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因 产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,2.ELISA的局限性,有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。,最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）,四、Western blotting,电泳胶里的
9、蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。,Western（转膜）,胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。,膜,胶,蛋白,Western装置,Blotting,原理与ELISA相同。,待测蛋白,硝酸纤 维素膜,一抗,二抗,辣根过氧 化物酶,底物,产物，并发出光,PAGE胶,待测蛋白,底片曝光,辣根过氧化物酶：HRPO,1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。,2）洗去未结合的一抗。,3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。,4）清洗掉未结合的二抗。,5）用HRPO的底物浸泡膜。,6）暗室里曝光，冲洗胶片。,Blotting过程,结果,多克隆抗体Blotting的结果,单抗blotting结果,检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性优点：可形象地展示出特殊的蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合区域,五、DNase足迹实验（footprinting assay）,32p,1 5 10,*,1 4 8 10,*,加入蛋白质X,加入DNaseI凝胶电泳放射自显影,1,5,10,A B,足迹,(a),(c),(b),DNaseI 足迹实验,
