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1、免疫学检测技术及应用,免疫学检测技术及应用免疫学检测技术及应用 3. 抗原物质的定性、定量检测： 如：病原微生物与其代谢产物，组织细胞、蛋白质等 4. 免疫细胞的分离、鉴定与功能测定： 如：T细胞与其亚群等2,由于本人工作能力和接触项目有限，希望借此机会将自己的体会与大家分享，更希望大家能提出更多更为深刻的意见! 谢谢,免疫学检测技术及应用免疫学检测技术及应用免疫学检测技术及应用,3. 抗原物质的定性、定量检测： 如：病原微生物与其代谢产物，组织细胞、蛋白质等 4. 免疫细胞的分离、鉴定与功能测定： 如：T细胞与其亚群等,2,3. 抗原物质的定性、定量检测：2,抗原抗体反应抗原与相应抗体在体内
2、或体外相遇可发生特异性结合，呈现的某种反应现象。,3,抗原抗体反应3,抗原抗体反应有以下几个特点: 1.抗原与抗体结合是特异性结合 表位(抗原)超变区(抗体) 2.抗原抗体结合是分子表面的非共价键结合 氢键、疏水键、静电引力和范德华力(Van der waals force) 、电子云力的合力。 抗原和抗体可解离,性质不变。,4,抗原抗体反应有以下几个特点:4,3.抗原抗体反应可分为两个阶段 （1）特异性结合阶段 此阶段需时短,仅需几秒到几分钟,无可见 反应出现 （2）可见反应阶段 需时较长,数分,数小时或数日出现可见现 象,表现为沉淀,凝集,细胞溶解等 4.抗原和抗体结合是否呈现明显可见的反
3、应现 象,与两者的分子比例密切相关,5,5,6,6,抗原抗体反应的主要影响因素： 1.电解质: 在中性或碱性条件下,抗原抗体均带负电荷,适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而互相结合,出现明显的沉淀或凝集现象。 2.温度: 37 3. 酸碱度: pH6-8,7,抗原抗体反应的主要影响因素：7,抗原抗体反应包括： 沉淀反应 凝集反应 溶解反应 补体结合反应 中和反应 已知抗体 检测未知抗原； 已知抗原 检测未知抗体。,8,抗原抗体反应包括：8,Sensitivity of varior immunoassays,9,Sensitivity of varior immunoas,一、沉淀反应(
4、precipitation) 可溶性抗原与相应抗体在电解质存在条件下结合，出现沉淀物的现象。 沉淀反应的试验方法：环状法 絮状法 琼脂中沉淀法,10,一、沉淀反应(precipitation)10,琼脂中沉淀反应法： 双向免疫扩散(double immunodiffusion) 单向免疫扩散(single radial immunodiffusion) 对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis) 火箭电泳(rocket electrophoresis) 免疫电泳(immunoelectrophoresis),11,11,12,12,二、凝集反应(agglutin
5、ation) 颗粒性抗原或吸附于颗粒上的可溶性抗原(或抗体)于相应抗体(或抗原)，在电解质存在下出现凝集物的现象。,13,13,凝集反应包括： 直接凝集反应 (direct agglutination) 间接(被动)凝集反应(indirect/passive agglutination) 间接凝集抑制试验(indirect agglutination inhibition test) 协同凝集试验(coagglutination test) 抗球蛋白试验(antiglobulin test，Coombs test),14,凝集反应包括： 14,15,15,三.免疫标记技术 用荧光素、同位素、酶
6、与发光等示踪物质标记抗体(或抗原)，与抗原(或抗体)进行反应，通过检测示踪物质，分析被检抗原(或抗体)的存在或含量的方法。 灵敏度：高，1X10-4 1X10-5ug抗体/ml 应用：微量物质的定性、定量或定位。,16,三.免疫标记技术16,免疫标记技术的基本类型：（一）免疫荧光技术(immunofluorescence technique) （二）免疫酶技术(immunoenzymatic technique) （三）同位素标记技术(isotope labelling technique)（四）发光免疫测定(luminescent immuno-assay, LIA)（五）免疫胶体金标记技术
7、(colloidal gold immunogold staining),17,免疫标记技术的基本类型：17,（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检抗原的存在。 免疫荧光技术包括： 直接法 间接法 间接补体增强法,18,（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 18,Direct and indirect immunofluore-scence staining of membrane antigen (mAg).,19,Direct a
8、nd indirect immunofluo,（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques) 是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用相结合的一种方法。主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）,20,（二）免疫酶技术(immunoenzymatic 20,1.免疫酶染色(又称免疫组化技术, immunohistochemistry technique) 原理：用酶(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等) 标记抗体(酶标抗体)，将酶标抗体与抗原(细胞或组织切片)作用，抗原与酶标记抗体结合，加底物，酶催化底物产生有色物质，观察
9、结果。 应用：细胞内、组织内抗原的定性、定量和定位检测。,21,1.免疫酶染色(又称免疫组化技术,21,2.酶免疫测定 酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 原理：将抗原(或抗体)结合于固相载体；与抗体(或抗原)反应；加酶底物，酶促反应。 灵敏度：2X10-5 gml 应用：广泛，可检测微量抗体和抗原(如微生物成分、激素、细胞因子、粘附分子等）。,22,2.酶免疫测定22,ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法,23,23,ELISA,24,ELISA24,(三) 同位素标记技术(isotope-labe
10、lling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pgmL 特异性强 应用：微量抗原和抗体检测。 缺点：不稳定，废物处理麻烦等。,25,(三) 同位素标记技术(isotope-labelling,（四）发光免疫分析(luminescent immuno-assay, LIA) 原理：用发光物质标记抗体(或抗原),再同抗原(或抗体)进行反应，以发光现象作为抗原抗体反应的指示系统。 应用：定量检测抗原、抗体。 发光分为：化学发光(chemiluminescence) 生物
11、发光（bioluminescence）,26,（四）发光免疫分析(luminescent immuno-a,化学发光原理： 发光物质 激发态分子 基态分子 释放光子(发光) 化学发光剂：鲁米诺（luminol ） 反应剂：过氧化阴离子,反应剂,27,化学发光原理：反应剂27,（五）免疫胶体金技术(colloidal goldimmunogold staining) 原理：胶体金标记蛋白质(如抗体) + 组织细胞(待测) 观察结果(用电镜、光镜或肉眼) 应用：免疫组织化学定位，测定细胞表面标志和细胞内成分。 优点：易行、省时、价廉、灵敏度高。 胶体金：用还原法将四氯金酸(HAuCl4)制成特定大
12、小的金颗粒，该颗粒由于静电作用呈稳定的胶体状态，称为胶体金。,28,（五）免疫胶体金技术(colloidal goldimmu,淋巴细胞的检测技术一.淋巴细胞的分离 1.外周血单个核细胞(淋巴细胞 90%)的分离 密度梯度离心法,(密度为1.077),(2000rpm,15min),29,淋巴细胞的检测技术(密度为1.077)(2000rpm,15,2.尼龙纤维分离法： 单个核细胞 通过尼龙纤维柱 B细胞和单核细胞(粘附特性) T细胞(非粘附性)。3.流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光素标记抗体待检细胞单列经过FACS分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细
13、胞分类仪(fluore- scent activated cell sorter),30,2.尼龙纤维分离法： 30,流式细胞仪,31,流式细胞仪31,32,32,4.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细胞 + 抗体 通过磁场 分离磁珠结合细胞 +解离剂 获纯化细胞,33,4.磁珠分离术：33,34,34,淋巴细胞的功能测定技术（一）体外法 1淋巴细胞增殖检测3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA合成含量。灵敏度高，具有放射性。四甲基偶
14、氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性差。,35,淋巴细胞的功能测定技术35,二甲氧唑黄比色法（XTT）：XTT是一种MTT类似的四唑氮衍生物，活细胞将其还原成橘黄色甲瓒产物，水溶性，可直接酶标仪测定。加上电子耦合剂硫酸酚嗪甲酯（PMS）可提高其效率。快速、简便灵敏。XTT水溶液不稳定，现用现配，稳定性差。,36,36,四唑单钠盐法（WST-1）: WAT-1是一种类似于MTT的水溶性四唑盐，在PMS存在下被活细胞脱氢酶还原成橙黄色甲瓒产
15、物，水溶性，直接酶标仪测定。WAT-1的水溶液比MTT 和XTT稳定。结果稳定，灵敏度高。可多次用酶标仪重复检测结果。Cell-Counting Kit-8（CCK-8）: CCK-8中含有WST-8，较WST-1更新的四唑盐，检测原理与WST-1类似。操作更简便，检测结果更稳定、溶解性更高、灵敏度更高、保存时间更长。,37,四唑单钠盐法（WST-1）: WAT-1是一种类似于MTT的,（放射性核素摄取法）,38,（放射性核素摄取法）38,2.细胞毒试验(1) NK细胞的细胞毒活性测定 放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞 培养 靶细胞破坏，释放放射性核素 测c
16、pm值 NK细胞毒活性(%)= 100%,实验孔cpm值-自然释放孔cpm值,最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值,39,2.细胞毒试验实验孔cpm值-自然释放孔cpm值最大释放孔c, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞)LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸盐和硝基氯化四氮唑蓝) 形成甲基化合物(色) 测定OD570值 NK细胞毒活性(%)= 100%,实验孔OD值-自然释放孔OD值,最大释放孔OD值-自然释放孔OD值,40, 乳酸脱氢酶(LDH)释放法实验孔OD值-自然释放孔OD值,Antibody-dependent cell
17、-mediated cytotoxicity (ADCC）,41,Antibody-dependent cell-media,42,42,Generation of effector CTLs,43,Generation of effector CTLs43,MHC tetramers,44,MHC tetramers44,Two pathways of target-cell apoptosis stimulated by CTLs,45,Two pathways of target-cell ap,In vitro cell-mediated lympholysis (CML) assay
18、,46,In vitro cell-mediated lympho,3. 酶联免疫斑点法(ELISPOT) 抗原包被 B细胞 抗体产生并附着 第二抗体(酶标记) 底物 显色 抗体(抗细胞因子)包被 + T细胞 产生细胞因子并与抗体结合 + 第二抗体(酶标记) 底物 显色,47,3. 酶联免疫斑点法(ELISPOT) 47,48,48,49,49,50,50,（二）体内法 抗原定量注入皮内，4872小时后观察结果。 结果判定： 阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm 弱阳性：硬结直径0.5cm 阴性：无变化 实际意义： 阳性 细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性 多为细胞免疫功能低下者 * 常
19、用的抗原为结核菌素(OT) 、PHA,51,（二）体内法51,皮内注射法,52,皮内注射法52,划痕法,53,划痕法53,54,54,细胞因子的检测技术一、 生物学检测技术 依赖细胞株测定法 二、 免疫学检测技术 ELISA法三、分子生物学检测技术 分子杂交、PCR 等检测mRNA,55,细胞因子的检测技术55,细胞因子检测的特点 样品含量低样品具有时效性生物效应特异性差,56,细胞因子检测的特点56,Figure 14-12,57,Figure 14-1257,58,58,细胞因子的功能 Cell activation Cell growth and differentiation Indu
20、ction of MHC Induction of cytokine receptors Promotion of antibody class- switching,59,细胞因子的功能59,影响细胞因子作用特异性的因素 Only antigen-activated lymphocytes express receptors Different combinations of receptor subunits result in low-, intermediate-, or high-affinity receptors Requirement of cell-cell interact
21、ion Short half-life of cytokines Cytokine antagonists Synergistic and antagonistic interactions among cytokines,60,影响细胞因子作用特异性的因素60,限制细胞因子临床应用的因素High local concentrations of cytokines during immune response cannot be mimicked clinically Short half-life of cytokines Pleiotropic effects can cause unpr
22、edictable side-effects,61,限制细胞因子临床应用的因素61,细胞因子的生物学检测检测方法与原理 细胞增殖或增殖抑制试验 细胞病变抑制试验 细胞毒试验 细胞趋化试验,62,细胞因子的生物学检测62,检测中的操作注意要点 靶细胞的选择与培养 检测标本的制备 显示检测结果,2022/12/29,63,检测中的操作注意要点2022/10/263,靶细胞的选择与培养 1、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2、易培养、保存、生物学特性稳定 3、有良好的生长状态 4、种属适配,2022/12/29,64,靶细胞的选择与培养2022/10/264,各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子
23、实验系统 干扰因素 IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法 IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4 IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2 IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4,65,各类细胞因子检测的常用靶细胞65,各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H
24、）趋化法 GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5 TNF/ L929 （M、H）细胞毒法 IFN wish（H）病变保护法 IFN- IFN- L929（M）病变保护法 IFN- IFN-,66,各类细胞因子检测的常用靶细胞66,检测标本的准备 1、分离特定的产生细胞 2、对产生细胞进行诱导、激活 3、选择适当的收集时间,2022/12/29,67,检测标本的准备2022/10/267,显示检测结果 1、细胞增殖状态的显示： 放射性核素掺入法、 胞内酶活性显示法 活细胞染色法 细胞荧光测定法 2、细胞毒或细胞病变状态的显示 活细胞染色法 胞内酶活性显示法 D
25、NA断片测定法,2022/12/29,68,显示检测结果2022/10/268,依赖细胞株测定法PBMC + PHA 培养 取上清液 + CTLL-2细胞 培养 + MTT 培养 测OD570值,69,69,TNF对靶细胞的细胞毒活性 TNF对小鼠L929成纤维细胞株具有细胞毒活性，细胞死亡率与TNF生物学活性成正相关关系。 结晶紫染色死细胞 MTT检测活细胞 如同时加用转录抑制剂放线菌素D，可提高靶细胞对TNF的敏感性10-100倍。,70,TNF对靶细胞的细胞毒活性70,滤膜：计数受趋化细胞,趋化因子,细胞,趋化试验原理示意,71,滤膜：计数受趋化细胞趋化因子细胞趋化试验原理示意71,细胞
26、因子的免疫学检测 分泌型细胞因子的检测 ELISA ELISPOT RT-PCR（分子生物学） 细胞内细胞因子的检测 免疫组化技术,72,细胞因子的免疫学检测72,细胞因子受体的存在 形式 膜型细胞因子受体 分泌型细胞因子受体,2022/12/29,73,细胞因子受体的存在 形式2022/10/273,细胞因子受体的检测方法 膜型细胞因子受体的检测： 配体检测法 抗体检测法 分泌型细胞因子受体的检测： 标记抗体检测法,2022/12/29,74,细胞因子受体的检测方法2022/10/274,细胞因子检测临床意义细胞因子 正常对照 病人 疾病 年代与受体 （pg/ml） （pg/ml） IL-1
27、 0.160.17 0.530.57 肾细胞癌 2003 0.3 18.8 心绞痛 1996 166.7 38.528.8 胰腺炎 1994 IL-2 2.40.8 10.81.8 急性缺血性综合征 1999 IL-4 3.340.84 4.051.02 支气管高反应性 2003 IL-6 54.1 485.2 疟疾 2004 1.792.03 8.9113.12 肾细胞癌 2002 42 1620 败血症 2001 2.10.1 101.6 风湿 2000 2.55 4.29 非酒精性脂肪肝 2003 1.10.1 18.62.1 原发性甲状旁腺功 1996 能亢进症 4.340.9 97.
28、30.97 宫外孕 1996 12.30.8 9412.1 类风湿关节炎 1999 0.39 16 关节炎 2004 1.20.6 10.81.8 急性缺血性综合征 1999IL-6受体 25.11(ng/ml) 41.71.2(ng/ml) 原发性甲状旁腺功能 1996（可溶性） 亢进症,75,细胞因,续表细胞因子 正常对照 病人 疾病 年代与受体 （pg/ml） （pg/ml）IL -8 63 331 败血症 2001 3.8 43.68 非酒精性脂肪肝 2003 16.3 1078181.5 泌尿道感染 1993 1 17.6 肝癌 2003 4.80.5 27.52.6 轻度子宫内膜异
29、位症 2003 530.265.1 重度子宫内膜异位症IL-10 14.1 1099.3 严重疟疾 2004 9.21.5 17.74.4 非小细胞肺癌 2002 214.2 转移癌IL-13 35.2012.70 92.699.87 系统性红斑狼疮 2005IL-15 16.24 356 腹膜炎 2000IL-16 16323 28746 轻度子痫 2008 （正常妊娠） 51558 严重子痫IL-18 2811 5121 充血性心力衰竭 2000IL-21 46690(ng/ml) 1051335(ng/ml) 原发性干燥综合征 2007,2022/12/29,76,77,77,细胞内细胞
30、因子的测定技术（ICS） 激活细胞：多克隆激活剂，如佛波酯（PMA）和离子霉素（ionomycin）等或特定的抗原； 抑制细胞因子释放：阻断胞内高尔基体介导的蛋白质转运，用布雷菲德菌素A（Brefeldin, BFA）与莫能霉素（Monensin）等药物； 增加细胞膜通透性：多聚甲醛固定和皂角苷破膜； 荧光标记的抗细胞因子的特异抗体与细胞内细胞因子结合，通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）进行检测。,78,细胞内细胞因子的测定技术（ICS）78,Principle of Plate-Based ICS Assays,Antigenic stimulus + brefeldin
31、 A,Incubate 6-24 h,Fix cells Permeabilize Stain,20 ml PBMC/WB sample,Gate on cellsof interest,79,Principle of Plate-Based ICS A,ICS 应用,Measure production of cytokines in short-term stimulated whole blood, PBMC, etc.Can measure multiple cell-surface and intracellular markers in combination, using mul
32、tiparameter flow cytometryCan detect rare events such as antigen-specific T cells,80,ICS 应用Measure production of cy,Example of ICS Results,pp65 protein,peptide mix,A2 peptide,CMV lysate,CD8,CD4,anti-IFNg FITC,CD69 PE,81,Example of ICS Resultspp65 pro,CFSE Assays,Cells (usually PBMC) are labeled with
33、 CFSE dye, then allowed to proliferate in vitro (or in vivo in mice)CFSE is divided equally among daughter cells, so each generation becomes half as intense in CFSE staining,82,CFSE AssaysCells (usually PBMC,免疫分子生物学技术1.免疫印迹试验(immunoblotting, Western blotting)(1)电泳：抗原(如蛋白质)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内电泳，各组分按分子量大小分开
34、。(2)转印：将电泳后的蛋白质转移至硝基纤维膜上。(3)鉴定：用酶标记或同位素标记的抗体确定抗原的位置，并可得知其分子量的范围。,83,免疫分子生物学技术83,84,84,2.免疫PCR (immuno-polymerase chain reaction)原理： 抗原包被 + 抗体 + 亲和素-SPA融合蛋白 + 生物素-DNA片段 PCR扩增 测定扩增产物应用： 同一样品中多种抗原的分析与鉴定。,85,2.免疫PCR (immuno-polymerase cha,86,86,Thanks !,87,Thanks !87,汇报结束,谢谢大家!,请各位批评指正,汇报结束谢谢大家!请各位批评指正,
