免疫组化技术课件.ppt

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1、免疫组化技术,免疫组化技术免疫组化技术四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Western blot）细胞培养技术局限性 联合应用,免疫组化技术免疫组化技术免疫组化技术四大常用基本技术逆转录-,四大常用基本技术,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）免疫组织化学技术（免疫组化）免疫印迹技术（Western blot）细胞培养技术,局限性 联合应用,四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）局限性,免疫组织化学技术,免疫组化 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)

2、显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。抗原（antigen）：蛋白质具有抗原性。抗体（antibody） ：能与抗原特异性结合的免疫球蛋白Immunoglobin（Ig）。,免疫组织化学技术免疫组化 免疫组化是利用抗原与抗体特异性结,免疫组化技术的分类,按标记物质的种类 如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。按染色步骤 可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。,免疫组化技术的分类 按

3、标记物质的种类,基本原理,一抗,+,基本原理抗原一抗+二抗标记的抗原抗体复合物一抗,免疫组化的全过程,免疫组化的全过程抗原的提取 与纯化免疫动物或细胞融合，,常用标本的获得,组织标本和细胞标本两大类石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片细胞爬片和细胞涂片,常用标本的获得组织标本和细胞标本两大类,免疫组化对组织和细胞标本的要求 ：保持所检标本原有的结构、形态； 在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。,标本的处理,免疫组化对组织和细胞标本的要求 ： 标本的处

4、理,标本的获得,标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。 取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。 避开坏死区：细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。,标本的获得标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有,标本的固定与保存,目的：使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态； 对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免在染色和反复清洗的过程中抗原失活或弥

5、散。,好的固定剂：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应,标本的固定与保存目的：好的固定剂：,常用固定剂,常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。 醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 醇类（常用乙醇） 其它 （丙酮）,常用固定剂常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。,常用固定剂,甲醛(福尔马林)应用最广 原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。 优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基

6、，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。,常用固定剂甲醛(福尔马林)应用最广 原理：形成分子间的交联,常用固定剂,组织块不宜过厚。缩短固定时间。降低固定温度。 改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液，减少固定液pH的变化。 固定后充分水洗以减少分子间交联。 切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。,常用固定剂,常用固定剂,多聚甲醛(常用4%)： 用于免疫荧光染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各

7、类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。,常用固定剂多聚甲醛(常用4%)：,戊二醛： 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。,常用固定剂,戊二醛： 穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常,常用固定剂,乙醇（最常用）原理：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。 优点：穿透性强、抗原性保存好。 缺点： 脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。 乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。,常用固定剂乙醇（最常用）原理：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。,常用固

8、定剂,丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本。,常用固定剂丙酮： 对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用,冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片方法。冰冻切片制片方法简单较好的保存组织的抗原免疫活性，避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮,组织学切片制作,冰冻切片和石蜡切片是免疫组化中最常用的制片方法。组织学切片,石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法较好的保持组织细胞的形态结构切片有连续性长期存档，供回顾性研究由于石蜡切片可以切到4微米左右，所以原位杂交探针容易渗透到

9、组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。抗原的保存量不如冰冻切片。,组织学切片制作,石蜡切片：观察组织细胞结构的理想方法组织学切片制作,抗原修复,化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶加热方法 水浴加热法 微波照射法 高压加热法,抗原修复化学方法 ：胰蛋白酶、胃蛋白酶,抗原修复,化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 胰蛋白酶：主要用于细胞内抗原的显示；-：一般使用浓度为0.050.1，消化时间为37 度1040min， 胃蛋白酶：主要用于细胞间质抗原的显示。一般使用浓度为0.1%0.4，消化时间为37 度30180min， 例如：La

10、minin、CollagenIV,抗原修复化学方法 :主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露,抗原修复,水浴加热法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。 优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， 缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。,抗原修复水浴加热法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热,抗原修复,微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。 优点：此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再

11、现效果好。,抗原修复微波照射法 ：将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微,抗原修复,高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压 23min，可取得极好的效果。 优点：由于高压下受热均匀，特别适用于大批量标本的染色。 应用于一些较难修复的抗原。,抗原修复 高压加热法暴露抗原 ：将玻片浸入抗原修复液内，置高,抗原修复,加热法的注意事项 ：达到规定的温度(9295 C以上) 维持一定的时间； 避免切片干涸 (抗原可能完全丢失)； 加热后必须经过室温自然冷却2030分钟，使未折叠的蛋白分子链恢复天然构型； 修复液：最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸橼酸盐缓冲液；,抗原修复加

12、热法的注意事项 ：,抗体的结构：每个抗体都含有两个较小的 蛋白质 （轻链）和两个较大的蛋白质（重链）。组成 抗体 的这四个蛋白质通过二硫键（ S-S ）结合在一起。 Fab（fragment antigen binding）：该端是抗体与抗原特异性结合的部位 Fc（fragment crystalline）：是免疫球蛋白的羧基端，因其纯化时呈结晶状态而得名，该片断与特异性的识别抗原有关。,抗体,抗体的结构：TissueAgAgFabFc抗体,抗体的分类,多克隆抗体：多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。常用的多克隆抗体一般

13、在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（rabbit against human）表示。单克隆抗体：单克隆抗体是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。小鼠抗人的抗体常以MaH（mouse against human）表示。,抗体的分类多克隆抗体：多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物,抗体的选择（一抗）,单克隆抗体：针对某一抗原决定簇，由单一淋巴细胞产生的抗体。多克隆抗体：多株B细胞针对多个抗原决定簇产生的抗体。单克隆抗体的特异性更强，多克隆抗体的敏感性更高。如何使用二者完全取决于使用者的目的。弄清一抗的动物来源对后续二抗的选择至关重要。,抗体的选择（一抗）单克隆抗

14、体：针对某一抗原决定簇，由单一淋巴,一抗的获得,商品化一抗：Millipore、Cell Signaling、 Abcam、Santa Cruz 等。自己制备或定制,一抗的获得商品化一抗：Millipore、Cell Sign,抗体的标记（二抗）,在抗体上用化学方法连接某种标记物，目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到。荧光素-异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明（TRITC）酶-辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（ALP）重金属-胶体金,抗体的标记（二抗）在抗体上用化学方法连接某种标记物，目的是使,常用的染色方法,根据标记物的不同：免疫荧光法免疫酶标法亲和组织化学法以一种物质对某种组织成分具有

15、高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用（ABC法）。,常用的染色方法根据标记物的不同：抗原一抗二抗,常用的染色方法,免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。 基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。 优点：由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。,常用的染色方法

16、免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。,荧光素 作为染料在激发光照射下能产生荧光的一类化合物,荧光素 FluorochromeExcitation,荧光显微镜,短波长的激发光激发出长波长的荧光。紫外线 蓝光蓝光 绿光绿光 红光,荧光显微镜短波长的激发光激发出长波长的荧光。,免疫荧光染色,免疫荧光染色,免疫荧光双标染色,免疫荧光双标染色,荧光显微镜与激光共聚焦显微镜,荧光显微镜：X光片效果激光共聚焦显微镜：CT效果 用于目的蛋白的精确细胞内定位分析,荧光显微镜与激光共聚焦显微镜荧光显微镜：X光片效果,常用的染色方法,免疫酶标方法：继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。 基本原理：先以酶标记的

17、抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。 优点：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。 目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等。,常用的染色方法免疫酶标方法：继免疫荧光后，于60年代发展起来,常用的标记酶及其显色底物 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)： DAB或AEC显色系统 （结果染为棕黄色）碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)： NBT/BCIP（结果染为蓝黑色

18、）,常用的标记酶及其显色底物,DAB显色,辣根过氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黄色产物,DAB显色辣根过氧化物酶（HRP）+DAB溶液=棕黄色产物,ABC法（avidin-biotin complex亲和素-生物素法）： 组成： 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）,生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与

19、抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将其与过量的抗生物素反应而制备的。,ABC法（avidin-biotin complex亲和素-,优点： 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构，它利用亲和素为中介，一端通过生物素化的抗体连接一抗，一端通过生物素化酶与显色系统相连接，产生多级放大，从而提高生物反应的敏感性和特异性。生物素和亲和素有很强的亲和力，比抗原-抗体的亲和力要高一万倍以上。,优点：,免疫胶体金技术：以特殊的金属颗粒胶体金作为标记物。基本原理：胶体金是金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，

20、对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。优点：由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。,常用的染色方法,免疫胶体金技术：以特殊的金属颗粒胶体金作为标记物。常用的染色,背景染色,免疫组化中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性染色。常出现在组织边缘、胶原纤维及血浆渗出处，坏死组织及固定不良的组织中心处。表现为弥漫性，均匀性的背景染色。也可以是随机分布的阳性反应产物点、团或块状。,背

21、景染色免疫组化中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性染,Cub ilin分布于近端小管的刷状缘和近官腔面, 而在远端小管和细段及集合管上无分布。远端小管有背景, 淡棕黄色( 图1、2)。组织上无背景, 远端小管胞质为淡蓝色（图3、4）,Cub ilin分布于近端小管的刷状缘和近官腔面, 而在远端,Ig与Fc受体结合 ：多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋巴细胞，单核细胞，组织细胞表面多），主要是和二抗反应，因为一抗一般稀释度均较大，因此Fc受体的干扰基本不存在。由于福尔马林固定破坏了大部分的Fc受体，所以石蜡切片不多见。二抗与组织中的Ig结合：如羊抗兔的二抗，二抗可以标本中（人）Ig发生

22、交叉反应，科学上越接近的动物，交叉反应越明显，如人与猴，兔与豚鼠。,背景染色的原因,Ig与Fc受体结合 ：多见于冰冻切片（特别是淋巴造血组织，淋,静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织相结合，如胶原纤维。组织中残存醛基与Ig的结合内源性过氧化物酶,背景染色的原因,内源性HRP:3% H2O2 /甲醇室温20分钟内源性ALP:左旋米唑,静电吸附 抗体是一种带负电荷的球蛋白，容易和带正电荷的组织,缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看。非特异性组分与抗体结合，延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果

23、。必要时也可采用2-5%的BSA封闭，减少非特异性染色。适当增加PBS冲洗次数和浸洗时间，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要,阻断背景染色,缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制阻断背景染色,内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色； 缩短DAB孵育时间或降低DAB浓度/过氧化氢浓度等； 防止标本染色过程中出现干片，这容易增强非特异性着色。,阻断背景染色,内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞,设立对照组,对照的设置： 免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，判断染色是否成功的关键依据，

24、而且也是检测抗体的质量标准，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。 阳性对照：应呈阳性结果，说明本次实验操作无问题。阴性对照：常用PBS代替一抗，实验结果为阴性，用以排除假阳性结果。,设立对照组对照的设置：,空白对照/阴性对照：第一抗体由PBS取代。 替代对照：与第一抗体同种动物的非免疫性的正常血清代替第一抗体结果为 阴性。如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非 免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照 。 阳性对照：用已知含有要检测抗原的切片作阳性对照。 自身对照：在同一切片上，将不同组织成分中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如果应为阳性的组织是阳性，

25、则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。,设立对照组,空白对照/阴性对照：第一抗体由PBS取代。 设立对照组,免疫组化技术课件,免疫组化结果分析,阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组36张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。,免疫组化结果分析 阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，,免疫组化技术课件,灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用Image pro plus进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。注意：所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在更换视

26、野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。,免疫组化结果分析,灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域,曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在附近。过低过高都不好。注意相机白平衡：如果使用的是专业CCD相机，会有校正白平衡的功能，此时应对空视野进行白平衡校正。很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意有时候这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏色。,曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白色背景的亮度，应该在,评分法：通过在光学显微镜下对

27、组织切片分别按染色程度（03分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（14分为025%、2650%、5175%、76100%），最终可以分数相加，再进行比较。,免疫组化结果分析,评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03分,相对定量分析,相同曝光时间、相同显色时间大体分为阴性、弱阳性、阳性,相对定量分析相同曝光时间、相同显色时间BDCAEFGH,染色过强,免疫组化常见问题,原因解决办法抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（,染色弱,免疫组化常见问题,染色弱原因解决办法抗体浓度过低，孵育时间过短提高抗体浓度，孵,免疫组化常见问题,染色阴性,免疫组化常见问题染

28、色阴性原因解决办法 操作步骤错误重新试验，,非特异性背景染色,免疫组化常见问题,非特异性背景染色原因解决办法操作过程中冲洗不充分每步冲洗3,特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性敏感性高定位准确、形态与功能相结合。,免疫组化特点,特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特,免疫组化应用,用途: 对目的蛋白进行定性、定位和定量分析。优点：能够明确目的蛋白的细胞定位、亚细胞定 位及多种蛋白之间的相互位置关系局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。,免疫组化应用用途:,1975 年，Southern 建立了将DNA 转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA

29、RNA 杂交检测特定的DNA 片段的方法，称为Southern 印迹法。人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,免疫印迹技术（Western blot）,1975 年，Southern 建立了将DNA 转移到硝酸纤,免疫印迹技术（Western blot）,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryamide gel electrophoresis，简称PAGE）分离样品中不同的蛋白质组分，利用电转移法将电泳分离的蛋白质从凝

30、胶转移至一种固相支持物，然后用免疫学原理来检测目的蛋白质。,免疫印迹技术（Western blot） 通过聚丙烯酰胺,工作流程,制备蛋白样品SDS-PAGE转膜：NC,PVDF免疫学检测,封闭一抗杂交二抗杂交底物显色/发光,工作流程制备蛋白样品封闭,蛋白样品的获得,来源：组织、细胞注意事项：避免蛋白降解 a. 新鲜组织 b. 低温下操作 c. 蛋白裂解液中加入蛋白酶抑制剂（cocktail) d. -70保存，尽量短期内使用,蛋白样品的获得来源：组织、细胞,蛋白样品处理,测定样品浓度蛋白变性：电泳样品要经过高温处理，其目的将SDS 与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。加

31、入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。,蛋白样品处理,SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）聚合交联成三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE电泳体系中加入SDS-SDS-PAGE,SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr）,丙烯酰胺(简称Acr）N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）TEMED过硫酸胺（AP）SDSTris-甘氨酸电泳缓冲液,SDS-PAGE,丙烯酰胺(简称A

32、cr）SDS-PAGE,Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在自由基存在时就会发生聚合反应形成凝胶。引发产生自由基的方法有化学和光聚合两种方法。 1）化学聚合 常用的催化剂系统有： （1）过硫酸胺（AP）TEMED(四甲基乙二胺)； （2）过硫酸胺DMPN(二甲基氨基丙腈)； （3）过硫酸胺三乙醇胺。 2）光聚合 由光敏物质核黄素代替过硫酸铵作催化剂。,Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在自由基存在,SDS阴离子表面活性剂，能够使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质上，使各种蛋白质-SDS复合物都带有相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩

33、盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小。因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。,SDS,SDS-PAGE电泳体系,电泳体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成。 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为 pH6.8的Tris-HCl。 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为 pH8.8 Tris-HCl。 电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。,SDS-PAGE电泳体系电泳体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶,不连续电泳：,电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。,2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值形成了凝

34、胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性 样品浓缩的主要因素。,不连续电泳： 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓,浓缩胶：大孔胶在浓缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸解离为H2NCH2COO-。效泳动率依次为Cl-蛋白质H2NCH2COO-由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,浓缩胶：大孔胶,分离胶：小孔胶由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大

35、小而被分离,分离胶：小孔胶,凝胶浓度与蛋白分离范围,凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)15,Staking gelSeparating gel,湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。,转膜,湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是,半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45 分钟）又好。,半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与,两种转移系统中都必须注意

36、防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD以上）建议湿转。 根据目的蛋白的分子量决定转膜时间。半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。,注意,两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存,膜,选择种类NCPVDF尼龙膜选择标准a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，

37、还要根据不同目的来挑选不同的转移膜,膜选择种类,膜的特点,膜的特点,免疫学检测,封闭一抗、二抗：工作浓度可通过预实验确定。显色,免疫学检测封闭,显色方法,化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短荧光底物法： Krypton 荧光底物,显色方法化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体,内参的选择,内参：对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。各组织和细胞中的表达相对恒定，

38、借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin,内参的选择内参：对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编,结果分析,保证内参照均一的情况下，比较目的条带,结果分析保证内参照均一的情况下，比较目的条带,RA,(一) 灌胶,(一) 灌胶,(二)电泳,(二)电泳,(二)电泳,(二)电泳,(三)转膜,(三)转膜,(三)转膜,(三)转膜,(四)免疫学检测,(三)转膜,(四)免疫学检测

39、(三)转膜,Western blot应用,用途:用于目的蛋白的定性、半定量、简单定位分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析优点：敏感，可显示蛋白分子量局限性：不能准确反应蛋白的细胞定位、亚细胞 定位以及多种蛋白之间的相互位置关系,Western blot应用用途:用于目的蛋白的定性、半定量,从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同,Western blotting：蛋白质免疫印迹利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。,从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blott,ELISA：酶联免疫吸附试验利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。,从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同,ELISA：酶联免疫吸附试验从蛋白水平检测角度，免疫组化技术,谢谢！,谢谢！,谢谢！,谢谢！,