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1、PCR反应原理及其操作,生物化工韩 栋,1.PCR的基本原理 2.PCR反应体系 3.PCR的基本步骤 4.PCR反应五要素 5. PCR 的反应流程,PCR的基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L,PCR的基本步骤,72,9
2、4,55,PCR循环,PCR的基本步骤,1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（94，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072，3060s）,PCR的基本步骤,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA变性形成2条单链,DNA单链与引物复性,子链延伸DNA加倍,高温变性,低温退火,中温延伸,PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。此循
3、环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。,理论扩增率：2n递增（n为循环次数），2530循环，目标DNA可增加109倍。实际扩增率：()n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106107。以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。,PCR扩增曲线,PCR反应五要素,1. 引物（primer）2. 酶 （Taq DNA polymerase） 3. dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 4. 模板 （template） 5. Mg2+ （m
4、agnesium）,1.引物,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,引物设计的原则,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右；引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb；引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成
5、引物二聚体，产生非特异的扩增条带；引物3端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处；引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性；引物量：每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会,2 .酶及其浓度,目前有两种Taq DNA 聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基因工程酶：大肠菌合成一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为1
6、00l时）；浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,3.dNTP的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系：dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降
7、低,4.模板（靶基因target gene）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一；传统DNA纯化方法：采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本；SDS：是溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。临床检测标本：可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增；RNA模板提取：采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防
8、止RNase降解RNA,5.Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响;在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜;Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR 的反应流程,温度与时间的设置循环次数,1、温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060退火，然后快速升温至7075延伸，对于较短靶基因（长度100300bp）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一
9、般采用94变性，65左右退火与延伸。, 变性温度与时间：,一般9394，1min足以使模板变性若低于93则需延长时间但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。, 退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的重要因素退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55作为选择最适退火温度的起点较为理想,Tm（解链温度）4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值（510）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性复性时间一般为3060s，足以使引物与模板之间完全结合,引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度：, 延伸温度与时间：,延伸温度：一般选择在7075之间常用温度为72过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min扩增10kb需延伸至15min延伸时间过长会导致非特异性扩增对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,2、循环次数,循环次数决定PCR扩增程度循环次数主要取决于模板DNA的浓度循环次数：选在3040次之间循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,
