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1、利用大肠杆菌生产胰岛素,基因工程育种,利用大肠杆菌生产胰岛素基因工程育种,胰岛素作用机理,胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。作用机理属于受体酪氨酸激酶机制。,胰岛素作用机理 胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素，也是唯,（一）调节糖代谢,胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。通过激活丙酮酸
2、脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。,（一）调节糖代谢胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并,（二）调节脂肪代谢,胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离脂肪酸减少，同时抑制脂肪的分解氧化。胰岛素缺乏可造成脂肪代谢紊乱，脂肪贮存减少，分解加强，血脂升高，久之可引起动脉硬化，进而导致心脑血管的严重疾患；与此同时，由于脂肪分解加强，生成大量酮体，出现酮症酸中毒。,（二）调节脂肪代谢胰岛素能促进脂肪的合成与贮存，使血中游离
3、,（三）调节蛋白质代谢,胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白质的合成，一方面抑制蛋白质的分解，因而有利于生长。腺垂体生长激素的促蛋白质合成作用，必须有胰岛素的存在才能表现出来。因此，对于生长来说，胰岛素也是不可缺少的激素之一。,（三）调节蛋白质代谢胰岛素一方面促进细胞对氨基酸的摄取和蛋白,（四）其它功能,胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入细胞内；可促进脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。,（四）其它功能胰岛素可促进钾离子和镁离子穿过细胞膜进入,生产步骤,1.提取目的基因2.提取质粒 3.基因重组 4.将质粒送回大肠杆菌 5.胰岛素的产生,生产步骤1
4、.提取目的基因,1.提取目的基因,既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性内切酶将目的基因从原DNA中分离。1.鸟枪法：用一大堆限制性核酸内切酶对附近基因进行剪切，再提取所需要的。至于如何筛选，用DNA分子杂交，即DNA探针2.人工合成法：根据转录蛋白或者mRNA推导出基因序列，然后人工合成，没有内含子3.从基因文库中提取：也就是事先已经提取完毕的拿来用4.PCR扩增技术：用于大量生产该段基因片段，用于商业化运 作,1.提取目的基因既从人的DNA中提取胰岛素基因,可使用限制性,2.提取质粒,从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。此质粒将作为胰岛素基因的载体。1.碱裂解法：此方法适用于小
5、量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。2.煮沸法,2.提取质粒 从大肠杆菌的细胞质中提取质粒,质粒为环状。,3.基因重组,取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶将质粒切开,再使用DNA连接酶将目的基因与质粒“缝合”,形成一个能表达出胰岛素的DNA质粒。,3.基因重组 取出目的基因与质粒,先利用同种限制性内切酶,4.将质粒送回大肠杆菌,在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的物质,如CaCl2,这使细胞会吸收外源基因.此时将重组的质粒也放入培养液中,大肠杆菌便会将重组质粒吸收.将大肠杆菌用氯化钙处理，以增大大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒能够进入受体细胞，此时的细胞处于感受态（理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态）。,4.将质粒送回大肠杆菌 在大肠杆菌的培养液中加入含有Ca+的,5.胰岛素的产生,在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便产生出胰岛素蛋白质.通过大肠杆菌的大量繁衍,便可大量生产出胰岛素!注意：大肠杆菌产出的是多肽链，因为原核生物没有内质网、高尔基体等，不能进行多肽的折叠、修饰等，还需人为进行菌体外加工。,5.胰岛素的产生 在大肠杆菌内,质粒通过表达转录与翻译后,便,
