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1、DNA的生物合成(复制)DNA Biosynthesis，Replication,第 九 章,中心法则（central dogma）,遗传信息传递方向的规律,基因表达：,是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质的过程,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication,第一节,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另
2、一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目 录,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮N15-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代
3、DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、双向复制,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,Cairns复制模型型复制,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),（2）起始点和方向 原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的重复的保守顺序，可被酶识别。,方向：大多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。速度：
4、原核生物复制叉移动快(约105bp/min);真核生物复制叉移动慢(约51025103bp/min),复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,三、复制的半不连续性,领头链(leading strand),随从链(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(前导链）。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链（后随链、滞后链）。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,参与DNA复制的物质,底物(substrate)
5、:dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,目 录,聚合反应的特点,除了底物和酶外，DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53 的聚合酶活性2.核酸外切
6、酶活性,35外切酶活性,53 外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目 录,功能：53聚合酶活性；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用 3 5外切酶活性；主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配”53外切酶活性。主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补 可见，DNA pol是1个多功能酶,323个氨基酸,小片段,53核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 35核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进
7、行分子生物学研究中常用的工具酶。,功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol(250kD),亚基具有53方向合成DNA的催化活性亚基具有35外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线
8、粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶 拓扑异构酶,分 类,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把
9、两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。以N（大肠杆菌）或（真核细胞）为能源。,DNA连接酶(DNA ligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目 录,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,原核生物E.coli为例复制由起始点 oriC(origin)开始双向复制,E.coli的复制起始点oriC（245bp的DNA组分）序列分
10、析有如下特点 3组串连重复序列(13bp），每个顺序都由GATC开始 2组反向重复序列(9bp)4个dnaA蛋白结合部位,1、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在ATP存在下结合于四个9bp的重复序列。3、在类组蛋白（HU、ATP参与下,Dan A蛋白变性13个bp的重复序列,形成开链复合物。4、Dna B借助于水解ATP产生的能量在Dna C的帮助下沿5 3 方向移动，解开DNA双链，形成前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（Dna G蛋白）开始合成RNA引物。,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,引发体和引物
11、,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,DNA复制的调控是在起始阶段进行的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。复制起点是以一条链为模板起始DNA合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不在同一点上（不对称复制，如D环复制）。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是富含A.T。,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成
12、。,OH 3,3,目 录,领头链的合成,目 录,随从链的合成,目 录,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点，E.coli 有7个终止子位点。,新合成的两条染色体DNA分子相互连在一起，被拓扑异构酶IV分离,DNA复制的分子机制的基本特点,复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。复制时，DNA的两条链都从5端向3端延伸。,前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。DNA
13、的合成始于RNA引物的合成，因此前导链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每个都有RNA引物的合成。RNA引物随后由DNA片段替换，相邻的DNA片段连接形成一条完整的DNA链。DNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持DNA分子的准确性和忠实性。,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要D
14、NA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目 录,2009年
15、诺贝尔生理学/医学奖：端粒和端粒酶如何保护染色体,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),组成,端粒酶的爬行模型（动画演示）,真核生物DNA复制的特点,4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复 制；而在快速生长的原核生物染色体DNA复制中，起点可 以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多 的复制起点。,1、真核生物
16、染色体有多个复制起点，称为自主复制序列（ARS）或复制基因(replicator);多复制眼，呈双向复 制，多复制子。,2、冈崎片段长约200bp。,3、真核生物DNA复制速度比原核慢，速度为1000 3000bp/min(仅为原核生物的1/201/50）。,5、真核生物有多种DNA聚合酶,DNA聚合酶（）是真正的复制酶，在PCNA存在下有持续的合成能力。PCNA称为增殖细胞核抗原，相当于大肠杆菌DNA聚合酶的-夹子，RFC蛋白相当于夹子装配器。,6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，它是由许多成串的重短复序列组成，端粒功能是稳定染色体末段结构，防止染色体间的末端连接，并可补偿滞后链5-末段在
17、消除RNA引物后造成的空缺，使染色体保持一定长度。端粒酶是含一段RNA的逆转录酶.,7、RPA：真核生物的单链结合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶填补缺口。,至少依赖三种机制1、遵守严格的碱基配对规律2、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能（按模板要求选择底物）3、复制出错时有即时的校读功能,复制忠实性的保证,核酸的生物合成,三、DNA复制的调控,原核生物DNA的甲基化以及与细胞质膜的相互作用可以影响复制的起始时间。酶：Dam甲基化酶（腺嘌呤甲基化酶）位点：GATC中腺嘌呤的N6位 方式：游离的oriC,核酸的生物合成,复制时间与染色质结构、DNA甲基化以及转录活性有关
18、。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。复制许可因子（replication licensing factor）所控制.该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。由于该因子不能通过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体的复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。真核生物的复制起始是受多种因子的调控，这些因子的磷酸化和去磷酸化直接影响着复制的起始。,逆转录酶(reverse transcriptase),逆转录(reverse transcription),一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,分子生物学研究可应用逆转录酶，
19、作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNA complementary DNA,DNA的损伤（DNA damage）指一个或多个脱氧核苷酸的构成、复制或表型功能的异常变化，也称DNA损伤，又称突变（mutation）突变的结果引起遗传信息的改变。DNA的突变(损伤)大多数是自发的，是进化与分化的基础。,因素：自发突变 诱发突变,引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,化学因素,目 录,突变的分子改变类型,错配(mismatch)缺失(dele
20、tion)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,-,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,DNA损伤的修复,修复
21、(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,（一）光修复,光修复酶(photolyase),UV,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,E.coli的切除修复机制,目 录,（三）重组修复,（四）SOS修复,当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的
22、网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,酵母单杂交技术是一种研究蛋白质和特定DNA序列相互作用的技术方法,根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。,许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。,三磷酸腺苷双磷酸酶,ATP硫酸化酶,萤光素酶,荧光标记的dNTP,3羟基带有可被化学切割基团,
