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1、1发酵:把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。2发酵工程：应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学酶活性调节：是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。3为什么要采用高浓度微生物的培养？微生物液体发酵大都采用分批培养，这种培养方式的缺点是：发酵液中最终细胞浓度不高。如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖到很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大大提高发酵设备的利用率，降低生产成本。基于这种目的，人们开始
2、研究微生物高细胞浓度的培养技术。采用高细胞浓度培养技术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上高浓度细胞培养的方法:1流加培养2高细胞浓度连续培养3菌体循环利用等4四大工程:发酵工程( Fermentation )2酶工程 (蛋白质工程) 3基因工程 4细胞工程 5菌种：用于发酵过程作为活细胞催化剂的微生物，包括细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。 6具有生产价值的发酵类型有五种：微生物菌体发酵；微生物酶发酵；微生物代谢产物发酵；微生物的转化发酵；生物工程细胞的发酵7初级代谢产物：在菌体对数生长期所产生的产物，是菌体生长繁殖所必需的。8液体深层发酵优点：液体悬浮状态是很多微生物的最适生长环境
3、。在液体中，菌体及营养物、产物（包括热量）易于扩散，使发酵可在均质或拟均质条件下进行，便于控制，易于扩大生产规模。液体输送方便，易于机械化操作。厂房面积小、生产效率高，易进行自动化控制，产品质量稳定。产品易于提取、精制等。因而液体深层发酵在发酵工业中被广泛应用。 9自然选育在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程10诱变育种：就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。11表型迟延现象：突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表性的改变落后于基因型改变的现象成为表型延迟现象。12原料：从
4、工艺角度来看，凡是能被生物细胞利用并转化成所需的代谢产物或菌体的物料，都可作为发酵工业生产的原料。13培养基灭菌的定义：是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。14灭菌与消毒的区别：灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。15初筛一利用固体平板的生化反应进行筛选:1透明圈法2变色圈法3生长圈法4抑菌圈法；二随机分离方法啤酒发酵容器的变迁过程，大概可分为三个方面：（1）发酵容器材料的变化（2）开放式发酵容器向密闭式转变
5、；（3）密闭容器的演变。16圆筒体锥底发酵罐发酵的优点：1、加速发酵 C.C.T发酵和传统发酵相比，由于发酵基质(麦汁)和酵母对流获得强化，可加速发酵。C.C.T发酵由于罐高度要大于传统510倍，发酵液对流的三个推动力得到强化。发酵罐底部产生CO2汽泡上升，对发酵液拖曳力大。在发酵阶段，由于底部酵母细胞浓度大于罐上部，底部糖降快，酒精生成快，造成罐上、下部间密度差而造成对流。在发酵时控制罐下部温度高于上部(差12)，由于温差引起热对流，特别在发酵后期第一、二推动力减小后，温差对流更能发挥作用。 在C.C.T发酵技术中，主发酵结束不排酵母，全部酵母参于后发酵中VDK的还原，特别是凝聚性差的酵母，
6、发酵液有高浓度酵母参于VDK还原，大大缩短了还原时间。发酵温控自由，可以灵活采用各种温度(大多较高温度)下VDK的还原，更可以缩短后发酵周期。传统发酵酿造周期，低温发酵需50d以上，快速发酵需2530d，而C.C.T发酵如单酿罐发酵，酿造周期一般为1622d，如两罐法发酵一般2030d，即酿造周期可缩短1/31/2倍。可大幅度减少罐数，节省投资。2、厂房投资节省传统发酵必须在有绝热层的冷藏库内发酵和贮酒。 C.C.T发酵可以大部分或全部在户外，而且罐数、罐总容积减少，厂房投资节省。 3、冷耗节省，C.C.T发酵冷却是直接冷却发酵罐和酒液，而且冷却介质在强制循环下，传热系数高。传统发酵和贮酒，冷
7、量多消耗在冷却厂房、空气、操作人员和机器(如泵、电动机)、发酵罐支座等。根据计算和测定， C.C.T发酵比传统可节省40%55%冷耗。 4、发酵罐清洗、消毒传统发酵罐和贮酒罐基本上依赖人工清洗和消毒，根本无法实现自动化程序化。 C.C.T发酵可依赖CIP自动程序清洗消毒，工艺卫生更易得到保证。当然C.C.T发酵也有弱点。由于罐体比较高，酵母沉降层厚度大，酵母泥使用代数一般比传统低(只能使用56代)；贮酒时，澄清比较困难(特别在使用非凝聚性酵母)，过滤必须强化；若采用单酿发酵，罐壁温度和罐中心温度一致，一般要57d以上，短期贮酒不能保证温度一致。 17氧传递模型：当液体混合程度高，而且悬浮的细胞
8、被包围，上述传氧过程的限速步骤一般认为是氧分子通过液膜的扩散过程。（步骤3）因此我们用界面氧传递方程来描述氧传递速度（OTR）：CL 液体中溶解的氧的浓度kL 液膜传质系数a 气液两相的接触面积C* 氧在气液接解面的浓度18传氧系数及界面积（a）准确测定气液两相接触面积（a）是不可能的，因此将kL 和 a 合成一个整体，定义为 KLa.KLa 表示单位体积的传氧速率19提高KLa的途径(1)增加搅拌器转速，以提高搅拌轴功率可以有效地提高KLa；(2)加大通气量Q，以提高VS。在低通气量时，提高Q可以显著增大KLa。但当通气量已经很高时，进一步提高Q，Pg也将随之剧烈降低，其综合效果将不会使 k
9、La增加，甚而可能下降。*为了提高NV，除了提高 kLa之外，提高C*也是可行的方法之一。在空气中通入纯氧，或在可能时提高罐内操作压力，均可使C*增高，从而提高了氧传递的推动力。20传递系数KLa的测定:1 亚硫酸盐氧化法2复膜电极和氧分析仪法(动态法）溶氧电极法溶氧电极法最先进、最合理的方法 优点：耐高温 连续测量 原理：把溶解氧浓度转化为电流信号，由电流直接指示溶解氧浓度。阳极：阴极：应用溶氧电极测定KLa：通气搅拌系统的体积传氧系数KLa （1/hr）与溶解氧积累之间的关系： 测定步骤：（1）用此式测定时，先在培养过程中的某一时刻停止通气（A点），根据溶解氧浓度随时间的增加而减少的数据求
10、出QO2x。 （2）然后在溶解氧浓度下降到某一点（B点），再开始通气，C随着时间增加而增大，得dC/dt值（即曲线的斜率）（3）假定从通气停止过渡状态期间所求得的QO2X适用的话，则可用前式作图，并推算出C*和KLa值。21测定KLa的三个用途：1对生物反应器的传氧性能进行测定，以便选择最佳条件进行操作，并对其进行评价。2对发酵过程传氧性情况进行了解，以便判断发酵过程的供氧情况。3为通风罐的研究过程找出设备参数（如D/T），操作变数（如N搅拌器转数 Q通风量）与KLa的关系，以便进行运用发酵罐的放大和合理设计 22挡板的作用是改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。通
11、常，挡板宽度取(0.10.2)D，装设64块即可满足全挡板条件。全挡板条件：是指在一定转数下再增加罐内附件而轴功率仍保持不变。要达到全挡板条件必须满足下式要求：23常用的轴封有填料函和端面轴封两种。（1）填料函式轴封是由填料箱体，填料底衬套，填料压盖和压紧螺栓等零件构成，使旋转轴达到密封的效果。优点是结构简单。主要缺点是：死角多，很难彻底灭菌，容易渗漏及染菌；轴的磨损情况较严重；（2）填料压紧后摩擦功率消耗大；寿命短，经常维修，耗工时多。（3）端面式轴封又称机械轴封。密封作用是靠弹性元件（弹簧、波纹管等）的压力使垂直于轴线的动环和静环光滑表面紧密地相互贴合，并作相对转动而达到密封。优点：清洁；
12、密封可靠；无死角，可以防止杂菌污染；使用寿命长；摩擦功率耗损小；轴或轴套不受磨损；它对轴的精度和光洁度没有填料密封要求那么严格，对轴的震动敏感性小。缺点：结构比填料密封复杂，装拆不便；对动环及静环的表面光洁度及平直度要求高。 25空气分布管：空气分布装置的作用是吹入无菌空气，并使空气均匀分布。分布装置的形式有单管及环形管等。常用的分布装置有单管式，管口对正罐底中央，装于最低一挡搅拌器下面，喷口朝下，管口与罐低的距离约40mm，并且空气分散效果较好。若距离过大，空气分散效果较差。该距离可根据溶氧情况适当调整，空气由分布管喷出上升时，被搅拌器打碎成小气泡，并与醪液充分混合，增加了气液传质效果。环形
13、管的分布装置，以环径di等于0.8Di（搅拌器直径）时最为有效。喷孔直径为58mm，喷孔直径向下，喷孔的总截面积约等于通风管的截面积。这种空气分布装置的空气分散效果不及单管式分布装置。同时由于喷孔容易被堵塞，已很少采用。 消泡器：消泡器就是安装在发酵罐内转动轴的上部或安装在发酵罐排气系统上的，可将泡沫打破或将泡沫破碎分离成液态和气态两相的装置。从而达到消泡的目的。 机械消泡装置类型：1、耙式消泡。2.涡轮式消泡器 3、离心式消泡器4、碟片式消泡器26轴功率：搅拌器输入搅拌液体的功率：是指搅拌器以既定的速度旋转时，用以克服介质的阻力所需的功率，简称轴功率27搅拌功率准数NP的求解：ReM104，
14、达到充分湍流之后，ReM增加， 搅拌功率P0虽然将随之增大，但NP保持不变，即施加于单位体积液体的外力与其惯性力之比为常数，此时对圆盘六平直叶涡轮 NP6圆盘六弯叶涡轮 NP4.7圆盘六箭叶涡轮 NP3.7P0=NPD5N3 某细菌醪发酵罐罐直径T1.8(米)；圆盘六弯叶涡轮直径D0.60米；一只涡轮罐内装四块标准挡板 ；搅拌器转速N168转分；通气量Q1.42米3分(已换算为罐内状态的流量)；罐压P1.5绝对大气压；醪液粘度1.9610-3牛秒米2；醪液密度1020公斤米3要求计算Pg(1)计算ReM ：ReM=5.25 105 104 (2)由NP ReM查NP ， NP =4.7(3)计
15、算P0 ；P0=NPD5N3= 8.18（千瓦）4)计算Pg：28空气除菌的方法：1辐射灭菌2加热灭菌3静电除菌4介质过滤29 无菌空气制备原理 惯性冲击滞留作用机理：如图所示，图上是直径为df的纤维的断面，当微粒随气流以一定的速度垂直向纤维方向运动时，空气受阻即改变运动方向，绕过纤维前进，而微粒由于它的运动惯性较大，未能及时改变运动方向随主导气流前进，于是微粒直冲到纤维的表面，由于磨擦粘附，微粒就滞留在纤维表面上，这称为惯性冲击滞留作用。拦截滞留作用机理：1气流速度降到临界速度以下，微粒不能因惯性碰撞而滞留于纤维上，捕集效率显著下降，但随时着气流速度的继续下降，纤维对微粒的捕集效率又有回升。
16、2原因是微生物直径很细，质量很轻，它随低速气流流动慢慢靠近纤维时，微粒所在的主导气流流线受纤维所阻，而改变流动方向，绕过纤维前进，并在纤维的周边流速度更慢，进到这滞留区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截滞留作用。3形成一层边界滞流区。滞流区的气流速度更慢，进到这滞留区的微粒慢慢靠近和接触纤维而被粘附滞留，称为拦截滞留作用。布朗扩散作用机理：直径很小的微粒在很慢的气流中能产生一种不规则的直线运动，称为布朗扩散。布朗扩散的运动距离很短，在较大的气速，较大的纤维间隙中是不起作用的，但在很慢的气流速度和较小的纤维间隙中，布朗扩散作用大大增加了微粒与纤维的接触滞留机会。重力沉降作用机理：重力
17、沉降是一个稳定的分离作用，当微粒所受的重力大于气流对它的拖带力时，微粒就容易沉降。就单一的重力沉降情况下，大颗粒比小颗粒作用显著，对于小颗粒只有在气流速度很慢时才起作用。一般它是与拦截作用相配合的，即在纤维的边界滞留区内，微粒的沉降作用提高了拦截滞留的捕集效率。静电吸附作用机理：干空气对非导体的物质相对运动磨擦时，会产生诱导电荷，纤维和树脂处理过的纤维，尤其是一些合成纤维更为显著。悬浮在空气中的微生物微粒大多带有不同的电荷，如枯草杆菌孢子20%带正电荷，20%带负电荷，15%中性， 这些带电的微粒会受带异性电荷的物体所吸引而沉降。此外，表面吸附也归属于这个范畴，如活性炭的大部分过滤效能应是表面
18、吸附的作用。30提高过滤效率的措施：1、减少进口空气的含菌数。可以从以下几个方面着手： 1）加强生产环境的卫生管理，减少环境空气中的含菌量； 2）提高空气进口位置（高空采风），减少空气进口含量； 3）加强压缩前的空气预过滤。2、设计和安装合理的空气过滤器。 3、降低进入总过滤器空气的相对湿度。主要从以下几个方面入手：1）采用无油润滑空压机；2）加强空气的冷却，去油水3）提高进入总过滤器的空气温度，降低其相对湿度。31杂菌：是指在发酵培养中侵入的有碍生产的其他微生物。 染菌：感染了对正常发酵有影响的其他腐败微生物或噬菌体。染菌的具体危害：1）分解产物；2）污染产品；3）抑制生产菌的生长和代谢的产
19、生；4）影响产物的提取32不同种类的杂菌对发酵的影响：青霉素发酵：污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害大；链霉素发酵：污染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌比粗大杆菌的危害大；四环素发酵：污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌的危害较大；柠檬酸发酵：最怕污染青霉菌；肌苷、肌苷酸发酵：污染芽孢杆菌的危害最大；谷氨酸发酵：最怕污染噬菌体；高温淀粉酶发酵：污染芽孢杆菌和噬菌体的危害较大33总染菌率：指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比。设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率，有利于查找因设备缺陷而造成的染菌原因。不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因。34不同发酵阶段
20、的染菌率：将整个发酵周期分成前期、中期和后期三个阶段，分别统计其染菌率。有助于查找染菌的原因。季节染菌率：统计不同季节的染菌率，可以采取相应的措施防止染菌。操作染菌率：统计操作工的染菌率，一方面可以分析染菌原因，另一方面可以考核操作工的无菌操作技术水平。35从染菌的规模来分析染菌原因：大批发酵罐染菌：首先可能是空气系统部分发酵罐（或罐组）染菌：1前期可能是种子带杂菌，或灭菌不彻底，中后期则可能是中间补料系统或油管路系统发生问题所造成的2个别发酵罐连续染菌：设备问题（如阀门的渗漏或罐体腐蚀磨损），设备的腐蚀磨损所引起的染菌会出现每批发酵的染菌时间向前推移的现象3个别发酵罐偶然染菌：原因比较复杂，
21、因为各种染菌途径都可能引起。36从染菌的类型来分析：1耐热性芽抱杆菌：可能是由于原料中原有的芽孢未能杀灭，或者死角或灭菌不彻底。2球菌、酵母：可能是从蒸汽的冷凝水或空气中带来的，或者设备渗漏。3浅绿色菌落（革兰氏阴性杆菌） ：发酵罐的冷却管或夹套渗漏。4霉菌：灭菌不彻底或无菌操作不严格5噬菌体：很可能是空气系统，特别是在大风天气后。37原料染菌的防治：1对于液体原料：采用连消方式2对颗粒状淀粉质原料或者小发酵罐，采用实消为好。而且升温时需搅拌，或加入-淀粉酶。38种子带菌的原因及防止1、带菌的原因；无菌室的无菌条件不符合要求，培养基灭菌不彻底，操作不当。2种子带菌的防止；种子带杂菌是发酵前期染
22、菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。40种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间41接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。42种子扩大培养：1.表面培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程43种子扩大培养：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 44生产菌种的来源：根据资料直接向科研单
23、位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； 分离筛选新的微生物菌种45小结：从自然界中分离微生物需要注意的问题: 1、明确目的：分离什么种类的微生物 2、寻找来源：从哪里分离 3、选择手段：充分考虑所分离微生物的生产能力、生长速度，选择适宜的培养分离方法和检测方法46培养基设计的基本原则：培养基的组成必需满足细胞的生长和代谢产物所需的元素，并能提供生物合成和细胞维持活力所需要的能量。 47为何要进行培养基的设计？ 完善的培养基设计是实验室的试验、实验工厂和生产规模的放大中的一个重要步骤。 在发酵过程中，我们的目的产品是菌体或代谢产物。而发酵培养基是否适合于菌体的生长或积累代谢产物，对最终产品
24、的得率具有非常大的影响48发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气染菌概率为10-349无菌空气制备的整个过程包括两部分：对空气进行过滤处理，除去微生物颗粒，满足生物细胞培养需要（无菌）对进入空气过滤器的空气进行预处理，达到合适的空气状态（温度、湿度、除油）50空气预处理目的：提高压缩前空气的洁净度，降低空气过滤器的负荷；去除压缩后空气中所带的油水，以合适的空气湿度和温度进入空气过滤器。设备：高空取气管 除尘器 空气压缩机 贮气罐 气液分离器 冷却器 空气加热器51染菌的后果：生产菌和杂菌同时生长，可能
25、会使生产菌丧失生产能力；在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难杂菌会降解目的产物，会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。“吃糖不吃菌”和“吃菌不吃糖” 52 连续发酵流程 预热加热保温冷却 连消喷淋冷却流程1.配料罐将培养基预热60-70，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。2.连消塔（加热塔）使培养基迅速（20 s)升温（126-132 ）。3.维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.4.冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ，输送到灭菌后的发酵
26、罐53影响灭菌的因素1. 培养基成分对灭菌的影响。油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性；另一些物质，如高浓度的盐类、色素等可削弱其耐热性。2. 培养基的物理状态对灭菌的影响3. 培养基中微生物数量对灭菌的影响4. 培养基中氢离子浓度对灭菌的影响培养基中氢离子浓度直接影响灭菌的效果。培养基的pH越低，所需杀灭微生物的温度越低。5. 微生物细胞中水分对灭菌的影响细胞含水越多，蛋白质变性的温度越低6. 微生物细胞菌龄对灭菌的影响老细胞水分含量低、低龄细胞水分含量高7. 空气排除情况对灭菌的影响8. 搅拌对灭菌的影响9. 泡沫对灭菌的影响54对菌种的要求1.不是致病菌2.发酵周期短,产量高
27、3.不易变异退化，抗噬菌体能力强4.最好是产生胞外产物的菌种,利于分离5.对医药和食品用产品还应考虑安全性55圆筒体锥底罐（C.C.T)简称露天锥形发酵罐C.C.T发酵和传统发酵相比，由于发酵基质(麦汁)和酵母对流获得强化，可加速发酵在C.C.T发酵技术中，主发酵结束不排酵母，全部酵母参于后发酵中VDK的还原，特别是凝聚性差的酵母，发酵液有高浓度酵母参于VDK还原，大大缩短了还原时间。 发酵温控自由，可以灵活采用各种温度(大多较高温度)下VDK的还原，更可以缩短后发酵周期。 传统发酵酿造周期，低温发酵需50d以上，快速发酵需25-30d，而C.C.T发酵如单酿罐发酵，酿造周期一般为16-22d，如两罐法发酵一般20-30d，即酿造周期可缩短1/3-1/2倍。可大幅度减少罐数，节省投资。56微生物发酵类型1 微生物菌体发酵2微生物酶发酵3微生物代谢产物发酵4微生物的转化发酵5生物工程细胞发酵57
