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1、第二部分 分离技术,生物活性分子的分离与表征,第3章、沉淀法第4章、吸附层析第5章、纸层析第6章、凝胶过滤层析第7章、离子交换层析第8章、亲和层析第9章、疏水层析,第9章 疏水层析 Hydrophobic Interaction Chromatography,9.1、概述9.2、疏水层析原理9.3、疏水层析介质9.4、疏水层析实验技术9.5、疏水层析的应用9.6、反相层析,9.1、概述,疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的层析技术。从作用机制来看，它属于吸附层析。,非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常
2、小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性(Hydrophobicity)。非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应(Hydrophobic effect)。,疏水效应,疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有聚集在一起形成最小疏水面积的趋势，保持这些非极性分子聚集在一起的作用则称为疏水作用。,对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包埋在蛋白质内部。最终的结构是最适合周围溶液的热动力学折衷的结果。,就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内
3、部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏水区域，这部分暴露在外疏水性基团称为疏水补丁。,疏水和亲水部件表面的溶菌酶。最疏水部分是深红色,浅红色的更少的疏水性。最亲水部分显示在深蓝色的,更少的亲水部分是浅蓝色。,高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用。盐能够增强疏水作用。,A),9.2、疏水层析原理,B),亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内
4、的疏水性残基；高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用。,一般在lmolL(NH4)2SO4 或 2molL NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起。然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。,也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用 高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来，疏水作用强的物质随后被洗下来）对于疏水性很强的物质，则需要在流动
5、相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。,疏水层析介质由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质。,9.3、疏水层析介质,HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基。,R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例可控制介质的配基密度,（A）丁基（B）辛基（C）苯基（D）新戊基,偶联至基质的常见配基类型,对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙三醇等)不仅可提
6、供足够的结合力，且避免了上述缺点。,常用商品化疏水层析介质,1.Butyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50mol 正丁烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。2.Octyl Sepharose 4 Fast Flow 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,配基结合量为每ml50mol正辛烷基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。,Phenyl Sepharose 6 Fast Flow工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14
7、，工作的最大速度是600cm/h配基结合量为每ml 40 mol苯基Phenyl，疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，,一、层析柱的制备1、层析介质选择 配基的性质与密度对决定疏水相互作用层析介质最终的选择性、结合能力起到重要的作用。,9.4、疏水层析实验技术,配基的种类和目的蛋白的性质在确定疏水相互作用层析的选择性方面是高度显著的参数。最合适的配基必须通过用目的蛋白进行筛选试验来确定。,图21 在使用一种苯基配基、同样的运行条件下三种单克隆抗体相互作用不同。,总的来说，疏水相互作用填料可以根据它们和样品组分的相互作用分为两类。直链烷基（丁基，辛基，醚基，异丙基）显示一个纯
8、的疏水性质，而芳香基配基（苯基）显示混合型性质，包括芳香性和疏水性相互作用。在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-Sepharose CL-4B吸附剂作固定相。,2、层析柱的选择柱床高度通常为515cm。对一个优化好的分离方案进行规模放大时，可保持柱高不变，增加柱的直径粗柱子（内径为1.6 5.0cm）适合进行HIC层析。,3、装柱将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose Cl-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间；采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物；并以50(mV)浓度悬浮于样品缓冲液中；尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。,二、盐的选择,在疏水
9、相互作用层析中，结合过程比洗脱过程更具有选择性。所以，优化起始缓冲液的条件很重要。正确选择的盐种类和浓度是影响载量和最终选择性的最重要参数。往平衡的缓冲液和样品中加入一种盐析盐，有利于固定化配基与蛋白质的相互作用。随着盐浓度的提高，结合到固定化配基上的蛋白质量也相应提高。,在实践中，钠、或铵的硫酸盐有效的促进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用，在蛋白质结构上有稳定作用。因此，最常用的盐：Na2SO4、NaCl和(NH4)2SO4。,在给定的浓度下，和其它的盐相比，硫酸铵能够给出最好的分辨率，但在pH高于8.0的情况下不推荐使用。硫酸钠是一种非常好的盐析试剂，但是在高浓度下，蛋白稳定性的问题
10、可能会阻碍它的应用。,图22 不同盐对选择性的影响：按顺序增大洗脱体积洗脱：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A、-糜蛋白酶原。,如果目的分子洗脱得太晚或根本不洗脱，或者不能更换到不同的填料，尝试使用50%的盐浓度结合。有些蛋白在高盐浓度下开始沉淀。起始缓冲液中的盐浓度需要降低以避免在运行中的沉淀。重复的以小量上样也能帮助避免由于沉淀引起的产量丢失。,图23 起始溶液中的盐浓度影响选择性和分辨率。,对于疏水相互作用，选择缓冲液离子并不致关重要。最经常使用磷酸缓冲液。pH 的选择必须和蛋白稳定性和活力兼容。然而，在疏水相互作用层析过程中，pH5-8.5对于最终的选择性和分辨率的影响都非常小。pH的增
11、加减弱疏水相互作用，在pH高于8.5或低于5的时候，蛋白的存留会更加显著的改变。,三、缓冲液,添加剂可以用来改善选择性和分辨率。例如，样品和疏水相互作用层析填料结合太紧时。然而，如果在高浓度使用，就有使目的蛋白失活或/和变性的可能。添加剂可以通过促进蛋白溶解性，改变蛋白构象，促进结合着的蛋白的洗脱来影响分离。水溶性醇、去垢剂等是疏水相互作用层析中最广泛使用的添加剂。,四、层析步骤,平衡上样平衡除杂洗脱,34,Equilibration,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Equilibrate the column and
12、 adjust the sample to binding conditions,Hydrophobic ligand,Gel matrix,Water molecules,Sample application,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Gel matrix,Washing out unbound material,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,Non-bound proteins,Elution,1.Equilibration2.Sa
13、mple application3.Washing4.Elution,Target elutes,Conc.salt,Abs,Elution,Conc.salt,Abs,1.Equilibration2.Sample application3.Washing4.Elution,More strongly bound proteins,加样,在进行任何疏水相互作用层析前，需确定样品的“盐稳定范围”。比如，加入逐步增加的盐至粗提物中，用来确定蛋白沉淀发生的浓度。确认样品在上样到柱子时低于该盐浓度，以避免沉淀。,样品制备：建立盐溶解性范围后，从最高的能够保持生物学活力而不发生沉淀问题的盐浓度开始。调
14、节样品到起始缓冲液的盐浓度来促进疏水相互作用。使用高浓度的储液调节盐浓度，以避免由于加入固体盐时局部盐浓度过高而造成沉淀。直接调节样品的pH。由于疏水相互作用对pH不是非常敏感，不需要完全的缓冲液交换。在上样前用简单的步骤净化所有的样品，这样可以避免堵柱子的风险，减少强力清洗步骤的需要，避免柱子性能的破坏和柱压的增加。,黏度随着温度而变化，在高盐浓度下会增加。样品的可溶性或黏度可能会影响柱子的上样量。高样品黏度导致畸变的流速样式，最终导致变宽的、破坏的峰和压力问题。稀释粘稠的样品。如果不能稀释，用更低些的盐浓度或具有更大颗粒大小的填料可能会帮助克服黏度问题。样品浓度通常应该不超过50毫克/毫升
15、。保证样品，柱子，起始和洗脱缓冲液都在同样的温度。,大多数条件下，增高温度会增强疏水相互作用，所以在更低的温度工作（通常低于10度）能够使由于疏水相互作用而导致的样品组分间的聚集最小化。降低温度可以作为通过加入去垢剂来提高可溶性的替代方案。,洗脱,（1）采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）。（2）通过往流动相中添加有机溶剂，如：乙二醇、丙醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱（溶剂中稳定性良好的物质）。（3）往流动相中添加去污剂等，去污剂本身能与介质发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换下来（分离膜蛋白）。,五、HIC柱的再生、清洁和贮存,轻度污染时，蒸馏水洗涤。污染物紧密结合时，
16、先用6 mol/L尿素或6 mol/L盐酸胍洗涤，再用起始缓冲液或贮存缓冲液洗涤。NaOH可用于溶解变性和沉淀的蛋白质及脂类 未使用的介质储存在封闭的容器中，在4-25的条件下保存。用过的介质应贮存在含有适当抑菌剂的溶液中，在4 8的条件下保存。,9.5、疏水层析的应用,1、多种生物大分子的分离纯化。2、去除DNA。在用基因工程生产的各种药物中,世界卫生组织(WHO)规定药物中DNA 的残留量应低于100pg/ml。利用HIC纯化技术则可以有效地除去残留的DNA,因为在DNA的结构中几乎不存在疏水区域,因此难以和疏水色谱填料结合而被除去。,3、一些脲变性或胍变性蛋白质的复性。将盐酸胍变性的牛血
17、清白蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶混合物通过HIC柱,30分钟内可获得除去变性剂、分离和完全复性三种功效。4、研究蛋白折叠机理。运用HIC技术可以对变性蛋白质复性过程中产生的中间体进行分离，通过对这些中间体的研究,可以了解蛋白质的折叠机理。,实例1：从杂交瘤细胞培养液中浓缩并纯化单克隆抗体,Sample:Hybridoma cell culture supernatant,mouse IgG1,anti-IgE.Ammonium sulfate added to 0.5 MColumn:HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HPStart buffer:20 mM potass
18、ium phosphate,0.5 M ammonium sulfate,pH 7.0Elution buffer:20 mM potassium phosphate,pH 7.0 Gradient:0100%elution buffer in 10 CVFlow:100 cm/h,在杂交瘤细胞培养液中产生的鼠IgG1 anti-IgE，和Phenyl Sepharose结合非常强，大多的胎牛血清蛋白流过了柱子，最终获得了高于95%的纯度的单抗。,实例2：从CHO细胞中获得重组乙肝病毒表面抗原（r-HbsAg）,乙肝病毒是一种能导致急性和慢性肝炎，肝硬化和原发性肝癌的感染因子。据估计，世界上5
19、%的人口都感染了这种病毒。可以用重组技术大规模生产重组乙肝表面抗原（r-HBsAg）来作为未感染人群的有效疫苗。由于r-HBsAg极端疏水，它和大多数疏水相互作用层析填料都能紧密结合，因此可使用疏水层析进行纯化。,Column:Butyl-S Sepharose 6 Fast Flow packed in XK 50/20,130 ml,穿透峰,洗脱峰,标准品,9.6 反相层析Reversed-Phase Chromatography,根据溶质的性质，采用极性的流动相和非极性的固定相的分离体系，利用固定相非极性基团的疏水效应而建立的一种分离模式。,反相层析介质的表面通常比疏水层析介质更加疏水。
20、这导致更强的相互作用，以至于为了成功的洗脱，需要用非极性的有机溶剂比如乙腈或甲醇。疏水相互作用层析则提供了利用生物分子疏水性的另一种方法，即通过在更极性的，变性能力更弱的环境下工作。反相层析具有极高的分辨率，可以分离只具有微弱疏水性差异的组分。,RP-HPLC separates rabbit and human insulin that differ by only a single amino acid.Column:VYDAC214TP54 Eluent:2730%acetonitrile(ACN)in 0.1%TFA over 25 minutes at 1.5 mL/minute.,
21、“反相”一词是从“常相”衍生出来的。常相层析是一种使用亲水固定相和含有己烷或氯甲烷等有机溶剂作为流动相的技术。在反相层析中，固定相是疏水的，所以使用了水/有机溶剂作为流动相使用，就是说，固定相比流动相更加疏水。反相层析填料作为吸附体而洗脱溶液作为流动相。,正相与反相色谱区别固定相,REVERSED PHASE：,NORMAL PHASE：,正相与反相色谱区别洗脱顺序,反相层析介质,载体：球形微粒多孔硅胶、特殊的高分子合成材料。特点：机械强度高；具有较多的可用于活化的羟基；微孔结构容易控制。,配基：烷基化合物，如C4、C8、C12、C18等。碳链越长，疏水性越大，稳定性越好。碳链长，所占空间体积
22、较大，介质表面可使用的有效孔径变小，柱效下降。,生物大分子：C4、C8的烷基；多肽：C18烷基,Peptide separation on different reversed-phase columns Columns:VYDAC218TP54(C18);214TP54(C4);219TP54(phenyl);Eluent:1530%ACN in 0.1%aqueous TFA over 30 minutes at 1.0mL/min.Sample:1.oxytocin,2.bradykinin,3.angiotensinII,4.neurotensin,5.angiotensinI.,反相
23、介质的合成,辛基硅胶介质的合成,过滤后分别用四氯化碳、丙酮溶剂洗涤，过夜即可。,4.5 g正辛基二甲基氯硅烷,40 g 四氯化碳,密闭容器,混匀，超声波脱气,100 mg硅胶载体,超声波脱气30 min,室温下反应24 h,常用反相柱的规格：30 mm2.1 mm100 mm 2.1 mm50 mm 1 mm介质颗粒度：5-7 m，孔径30 nm,流动相,流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液。由于生物大分子的疏水部分相差较大，流动相只用一种水溶液不能满足多分离组分的要求，在水溶液中加入一定比例的与之相混的有机溶剂，对其极性进行调整。常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
24、乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。,常用流动相：0.1三氟乙酸乙腈（TFAACN）系统。TFA特点：紫外吸收少可挥发，易除去可靠性 缺点：在190-250 nm波长下易造成基线漂移。可以通过调整溶剂A与溶剂B中TFA的量来消除。使用新鲜配制的TFA，不宜在储液瓶中长时间放置。,Significant differences in the peptide separation pattern due to differences in TFA concentration are evident.Column:C18(VYDAC218TP54).Flow rate:1 mL/min.Elue
25、nt:Gradient from 050%ACN in aqueous TFA,concentration as indicated.Sample:Trypticdigest of apotransferrin.Note:Only part of the chromatogram is shown.,洗脱液的选择,pH 离子对试剂有机修饰剂,最优的pH是需要建立得最重要的参数,Elution of five peptides at pH 2.0,4.4 and 6.5 with phosphate as the buffer.Column:VYDAC218TP54(C18,5 m,4.6 x
26、250 mm).Eluent:1530%ACN in 30 min at 1.0 mL/min;plus A.20 mMphosphate,pH 2.0 B.20 mMphosphate,pH 4.4 C.20 mMphosphate,pH 6.5 Peptides:1.bradykinin2.oxytocin3.angiotensinII 4.neurotensin5.angiotensinI.,离子对试剂,增加带电组分的疏水性，提高其与填料的结合，并因此改变滞留时间的通常方法是向洗脱液中添加离子对试剂。这些试剂通过离子相互作用和带电基团结合，因此抑制它们对整体疏水性的影响。由于大多数蛋白和
27、肽具有轻微的碱性，离子对试剂通常是酸，比如三氟乙酸（TFA），三乙胺之类的碱则用于带负电的分子。,有机修饰剂,开始洗脱时，需向洗脱液中添加有机修饰剂来增强洗脱力量。有机修饰剂必须可以和水互溶，不具有紫外吸光，以便检测正在洗脱的分子。沸点必须足够低以便洗脱后的挥发。,洗脱类型,梯度洗脱：分离纯化常用 梯度通常是由相对亲水的条件（高水含量，低有机修饰剂含量）向疏水条件（低水含量，高有机溶剂含量）进行。分步洗脱：脱盐,典型的反相色谱图,At 39%ACN,the retention time of lysozymeis nearly 18 minutes.Increasing the ACN con
28、centration to 40%reduces the retention time by more than half,to 7.6 minutes.Increasing the ACN concentration to 42%reduces the retention time of lysozymeagain by more than half,to 3.1 mintues.Column:VYDAC214TP54 Eluent:ACN at 39,40 and 42%in 0.1%aqueous TFA.,反相层析上的脱盐,Column:C18,4.6 150 mm.Flow rate
29、:1 mL/min.Eluent:Gradient from060%ACN in aqueous.1%TFA in 60 min.Temperature:As indicated.Sample:Trypticdigest of human growth hormone.,温度的影响,蛋白、肽、核苷酸和有机小分子的高分辨分离和分析。肽谱。纯度检查。脱盐与浓缩。,RPLC应用,疏水层析（HIC）与反相层析（RPC）的异同点,相同点：层析原理相同，都基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面的疏水效应而建立的层析模式。配基都是不同长度的烷烃或芳香类化合物。,不同点：层析介质表面的疏水性：RPCHIC配基
30、密度：HIC比RPC要低10-100倍流动相：RPC多采用酸性、低离子强度的水溶液，并加入一定比例有机修饰剂。HIC分离时，流动相一般为中性盐水溶液，pH68，通常不需有机添加剂。对蛋白质三级结构的影响：RPC过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附及其三级结构的不可逆变性。HIC则基本不破坏蛋白质的三级结构。,HIC对疏水性很强的蛋白质保留较强，但对亲水性蛋白质保留都十分弱。分离疏水性相差较大的蛋白质混合物，如细胞色素c和溶菌酶，用HIC会得到比RPC好得多的效果。通常在HIC分离纯化酶的过程中，失活最大不超过10%左右；而 RPC分离，酶活性一般会损失20%以上，甚至50%。所以活性蛋白质用HIC分离纯化较为理想。,思考题,1.疏水作用层析的固定相和流动相与普通吸附层析有何区别?为什么?2.从原理、操作和应用方面，比较亲和层析离子交换层析、凝胶层析与疏水层析的异同点？,
