《第20章重组DNA技术课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第20章重组DNA技术课件.ppt（98页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、第二十章,重组DNA技术,recombinant DNA technique,第二十章重组DNA技术recombinant DNA tec,第一节 重组DNA技术的基本过程Basic Process of Recombinant DNA Technology,*,2,第一节 重组DNA技术的基本过程Basic Pro,一、重组DNA技术相关概念,重组DNA技术（Recombinant DNA Technology）：,是在体外将不同来源的特异基因或 DNA片段插入载体分子，构建成重组 DNA分子；并将它导入到合适的受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，筛选出含有目的基因的转化子细胞；再进行扩增、获
2、取大量同一DNA分子。,*,3,亦称DNA克隆(DNA cloning)，或基因克隆(gene cloning)。,一、重组DNA技术相关概念重组DNA技术（Recombi,克隆化(cloning)：获取这类同一的DNA分子群体、细胞群体或个体群体的过程，即无性繁殖。,重组DNA(recombinant DNA,)：又称嵌合DNA（chimera DNA），采用克隆技术把来自不同生物的外源 DNA插入载体分子所形成的杂合DNA分子。,*,4,克隆(clone)：指从同一始祖经无性繁殖传代而来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体；,克隆化(cloning)：重组DNA(recombinant
3、,分,分离目的基因并进行必要的改造,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接目的基因与载体成重组载体,转,将重组载体转导入受体细胞,筛,筛选出含重组DNA的细胞等,二、DNA重组技术基本程序,*,5,思考题 1,分分离目的基因并进行必要的改造切限制酶切目的基因与载,重组DNA技术的基本过程（1）,*,6,重组DNA技术的基本过程（1）*6,重组DNA技术的基本过程（2）,*,7,思考题 1,重组DNA技术的基本过程（2）*7思考题 1,*,8,Common Enzymes Used in RecombinantDNA Technology,第二节重组DNA技术中常用工具酶,*8Common Enz
4、ymes Used in Recom,一、限制性核酸内切酶（restricton Endonuclease）,是一类能识别双链DNA中的某些特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶，又称为限制酶（restriction enzyme）。主要是从原核生物中分离纯化而来。,基因工程的手术刀-“切”,与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,*,9,一、限制性核酸内切酶 是一类能识别双链DNA中的,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,（一）限制酶的命名：,一、
5、限制性核酸内切酶,*,10,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；（一）限制,和型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时具有内切酶和甲基化酶活性，反应过程中需有Mg2+和ATP参与。,、和型（基因工程技术中常用型）。,（二）限制酶的分类：,型限制酶通常以同源二聚体形式存在，只具有核酸内切酶活性而无甲基化酶活性，反应过程中只需有Mg2+参与而不需有ATP参与。,*,11,和型限制酶通常是相对分子量较大的多亚基蛋白质复合物，同时,类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点，即具有双重旋转对称结构的DNA反向重复双链序列。,（三）型限制酶的作用特点：,1.基本特性：大部
6、分型限制酶都能识别由48个核苷酸组成的特定序列。,*,12,思考题 2,类酶识别序具有回文结构(palindrome)特点,*,13,图20-3 限制酶EcoR对双链DNA分子的切割作用,*13图20-3 限制酶EcoR对双链DNA分子的切割作,Bam H,GGATCCCCTAGG,Hind,GTCGACCAGCTG,平或钝末端（blunt end),粘性末端（sticky end),切口：平端切口、粘端切口,*,14,Bam HGGATCCGTCGAC+平端切口GGATCC+,GGATCCCCTAGG,GCCTAG,GATCC G,+,Bam H,GGATCCCCTAGG,GCCTAG,GA
7、TCC G,+,Bst,2.同裂酶 来源不同但能识别相同序列，切割 DNA后产生相同的黏性末端的限制酶，又称同功异源酶。,*,15,GGATCCGGATCC+Bam HGGATCCGGATC,Bam H,Bg l,GGATCC CCTAGG,AGATCT TCTAGA,GCCTAG,GATCC G,+,+,ATCTAG,GATCT A,3.同尾酶 识别序列不完全相同，但切割 DNA后，产生相同的黏性末端的限制酶称为同尾酶。这两个相同的黏性末端称为配伍未端(compatible end)。,*,16,Bam HBg l GGATCC AGATCTG GAT,4.可变酶 识别DNA序列中的一个或几
8、个碱基是可变的，并且识别序列往往超过6个核苷酸。为型限制酶的特例。,如：Bstp GGTNACC CCANTGG,*,17,如：Bbl CGGN(N)4CCG;GCC(N)4NGGC,4.可变酶 如：Bstp,（四）限制酶的应用及影响因素,1.限制酶的应用 重组DNA技术、基因组DNA物理图谱绘制、基因组DNA同源性研究、切割基因组DNA或cDNA构建基因组文库或cDNA文库等。,2.影响限制酶作用的因素 DNA纯度、结构及甲基度程度；酶切反应的温度、时间及缓冲液体系等。,*,18,（四）限制酶的应用及影响因素1.限制酶的应用2.影响限制,只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂口（
9、gap）。,是一种能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶。,二、DNA连接酶(DNA ligase),基因工程的缝纫针-“接”,需要在一条DNA链的3末端具有游离的羟基、另一条DNA链的5末端有磷酸基团，而且反应过程需要由ATP提供能量。,*,19,只能封闭DNA链上的缺口（nick）,而不能封闭裂,1.T4 DNA连接酶,连接的底物可以是两个双链DNA分子的互补黏性末端或平末端。最早是从T4噬菌体感染的大肠埃希菌分离，易制备，应用广。,（一）DNA连接酶的类型：,2.大肠埃希菌DNA连接酶,只能连接具有互补黏性末端的两个双链DNA分子底物。需要NAD+作为辅助因子。,*,20,1.T4
10、 DNA连接酶 连接的底物可以是两个双链DNA,连接黏性末端作用模式图：,*,21,连接黏性末端作用模式图：*GAATTC*,连接平末端作用模式图：,*,22,连接平末端作用模式图：*AGCT*,1.DNA连接酶应用,（二）DNA连接酶的应用及影响因素：,催化两个具有黏性末端或平末端的DNA片段形成磷酸二酯键，形成新的重组DNA分子；接合由复制叉上不连续复制链上产生的缺口；缝合DNA损伤修复、遗传重组及DNA链剪接中缺口。,*,23,1.DNA连接酶应用（二）DNA连接酶的应用及影响因素,2.影响DNA连接酶作用的因素,对黏性末端的连接效率远高于对平末端的连接；,*,24,连接黏性末端的温度一
11、般在415；,连接酶的用量，平末端连接用量高；,ATP浓度一般为0.011 mmol/L;,载体分子与插入片段的摩尔数比为1:101:3。,2.影响DNA连接酶作用的因素 对黏性末端的连接效率远高,三、DNA聚合酶,能够催化以DNA或RNA为模板合成DNA的反应，把脱氧核糖核苷酸连续地添加到双链DNA分子或引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。,（一）大肠埃希菌DNA聚合酶,（二）Klenow片段,具有53聚合酶，53 及35核酸外切酶活性。,具有53聚合酶，35核酸外切酶活性。,*,25,三、DNA聚合酶 能够催化以DNA或RNA为模板,（三）Taq DNA聚合酶,（四）反转录酶：依赖
12、RNA的DNA聚合酶。,具有53聚合酶，53 核酸外切酶活性，对Mg2+浓度非常敏感。,是第一个被发现的、耐热的、依赖DNA的DNA聚合酶，最佳反应温度为7075。,普遍使用的是来源于AMV(鸟类成髓细胞白血病病毒)及M-MLV(莫洛尼鼠白血病病毒)的反转录酶，具有53聚合酶。,*,26,（三）Taq DNA聚合酶（四）反转录酶：依赖RNA的DN,（一）末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase）,四、其它修饰酶,是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核糖核苷酸转移到单链或双链DNA分子的3-OH末端上。,(1)底物是单链DNA或有3突出末
13、端的双链 DNA。,*,27,（一）末端脱氧核苷酸转移酶 四、其它修饰酶 是一种,(2)底物是3平端或3凹端的双链DNA。,用途：,（1）主要作用是在载体或目的基因 3末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重组。,（2）DNA 3末端的同位素标记。,*,28,(2)底物是3平端或3凹端的双链DNA。Co2+dNT,（二）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）,能特异地切除DNA、RNA和dNTP上5-磷酸基团。,（三）多核苷酸激酶（polynuleotide kinase）,又称T4多核苷酸激酶，能催化ATP的-磷酸基团转移到DNA或RNA片段的5-OH末端。,*,
14、29,（二）碱性磷酸酶 能特异地切除DNA、RNA和dNTP,重组DNA技术中常用的工具酶,重组DNA技术中常用的工具酶工 具 酶功,第三节重组DNA技术中常用载体 Common Vectors in Recombinant DNA Technology,*,31,第三节重组DNA技术中常用载体 Common Vect,载体（vector）的概念,克隆载体(cloning vector),表达载体(expression vector),可使插入的外源DNA片段被转录、翻译成多肽链的载体。,是在克隆载体的基础上，增添了与宿主细胞相适应的强启动子，以及有利于表达产物分泌、分离或纯化的元件。,含有复
15、制起始点oriC，可使插入的外源DNA序列被扩增或保存的载体。,指能携带外源DNA分子进入受体细胞进行扩增和表达的运载工具。应具备的基本条件：,*,32,载体（vector）的概念克隆载体(cloning vec,含有复制起始点，具有自主复制的能力；,具有较高的遗传稳定性。,拷贝数较多，易于与受体细胞的染色体DNA分开；,分子质量相对较小，以容纳较大的外源DNA；,具有一个以上的选择性遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；,具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,载体应具备的基本条件：,*,33,含有复制起始点，具有自主复制的能力；具有较高的遗传稳,重组DNA技术中常用载体：,一、质粒载体：最常用
16、的目的基因克隆载体,粘粒载体：用于克隆大片段DNA(自习),M13噬菌体载体：用于Sanger双脱氧DNA测序(自习),二、噬菌体载体：构建基因组DNA或cDNA文库(自习),四、病毒载体：包括人或哺乳动物病毒、昆虫及植物病 毒用于在真核细胞中表达目的蛋白(自习),三、人工染色体载体：用于更大DNA片段的克隆(自习),*,34,重组DNA技术中常用载体：一、质粒载体：最常用的目的基因克隆,一、质粒(plasmid)载体,细菌培养,质粒存在于细菌染色质以外，具有自我复制能力的双链环状DNA。小的约23kb,大的数百kb。,严紧型质粒（stringent plaxmid）,松弛型质粒（relaxe
17、d plaxmid）,一、质粒(plasmid)载体细菌培养 质粒存在,Ampr,ORI,Tetr,（一）pBR322质粒：一种克隆质粒,ORI：,Ampr,Tetr：,两个抗性基因，用于筛选阳性克隆。,Pst I,BamH I：,两个酶切位点，用于插入目的基因,复制起始点，保证高拷贝自我复制。,*,36,目的基因与 pBR322经BamH I酶切后重组如何筛选得到阳性克隆？,AmprORITetr（一）pBR322质粒：一种克隆质粒O,克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆,*,37,克隆3,5,7,9,10 是阳性克隆TetTet平板1234,阳性克隆,*,38,Amp,Tet,阳性克隆*3
18、8AmpTet,DNA连接酶,重组质粒,目的基因,Ampr,Tetr,Pst I,目的基因与 pBR322经Pst I酶切后进行重组如何筛选得到阳性克隆？,课堂讨论,*,39,用Pst I酶切,DNA连接酶重组质粒目的基因AmprTetrPst I,（二）pUC质粒载体系列,Ori,分子量更小,拷贝数更高,*,40,（二）pUC质粒载体系列OripUC192686 bpA,pUC质粒载体插入了半乳糖苷酶N端肽片段的编码基因lac Z；产物肽也无活性，也不能分解培养基中的X-gal。,蓝白斑筛选,DH5a宿主菌染色体插入了半乳糖苷酶C端的肽片段的编码基因lacM15；产物肽无活性；不能分解培养基
19、中的X-gal。,有活性的半乳糖苷酶由肽和肽互补(互补)而成，可使培养基中的X-gal分解形成蓝色化合物而出现蓝色菌落。,*,41,pUC质粒载体插入了半乳糖苷酶N端肽片段的编码基,*,42,-半乳糖苷酶（+）,白色,蓝白斑筛选：,*42X-gal蓝色化合物-半乳糖苷酶（+）白,蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆,*,43,蓝白斑筛选,思考题 3,蓝色菌落：阴性克隆;白色菌落：阳性克隆*43 蓝,（三）其它质粒载体,1.能在体外转录克隆基因的质粒载体,由pUC系列质粒载体派生而来，带有来自噬菌体T7、SP6的启动子，为RNA聚合酶的附着提供了特异性识别位点。如pGEM-3Z/4Z.,2.穿
20、梭质粒载体（shuttle plasmid vector）,是一类人工构建的，具有两种不同复制起始点和选择标记，可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。,*,44,（三）其它质粒载体1.能在体外转录克隆基因的质粒载体,（四）TA克隆载体,许多耐热的DNA聚合酶(如Taq、Tth等)扩增时，都在PCR产物3-末端加上了A碱基。,是专为克隆PCR产物而设计的，在其MCS两侧的3-末端携带有未配对的T碱基的载体。,*,45,在连接酶的作用下可直接将PCR产物克隆到TA载体中。,（四）TA克隆载体 许多耐热的DNA聚合酶(如Taq,二、噬菌体载体（自习）,噬菌体(bacteriophage,ph
21、age),是一类细菌病毒，可用于克隆和扩增特定的DNA片段，是广泛使用的基因克隆载体。,野生噬菌体的基因组为线状双链 DNA，两端为12bp彼此完全互补，称之为 cos位点的5-单链突出黏性末端；进入宿主细胞后形成坏状双链结构，按方式及滚环方式进行复制。,感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。,*,46,二、噬菌体载体（自习）噬菌体(bacteriophage,gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),可容纳7 kb以下的外源片段。gt10和gt11分别在阻遏剂CI基因和lacZ基因上，有供外源基因片段插入的单一内切酶位
22、点。,可容纳923kb的外源片段。具有两个或两组内切酶位点，经酶切除去基因组中噬菌体正常生长非必需的序列，由外源基因片段取代。,（一）噬菌体载体,可插入的外源 DNA片段大，感染效率远高于质粒载体的转化效率。,*,47,gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆)EMBL,EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),黏粒载体结构特点：,分子小，可插入45 kb的外源DNA片段；,含质粒自主复制成分ORI，和耐药基因Amp
23、r；,含带有一个或多个单一酶切位点的多聚物接头；,含噬菌体cos黏性末端及与包装有关的短序列；,（二）黏粒载体,粘粒又称柯斯质粒(cos site-carrying plasmid,cosmid),是由噬菌体的cos黏性末端和细菌的质粒构建而成。,接上在真核细胞生活的元件，如SV40复制区及启 动子，可作为穿梭载体。,*,50,黏粒载体结构特点：分子小，可插入45 kb的外源DNA片,*,51,*51,（三）M13噬菌体载体,M13噬菌体基因组为闭环单链DNA，感染雄性大肠埃希菌后，在菌体内复制成相当于质粒的复制型（RF）M13双链DNA，可用作基因克隆载体。,M13mp系列(携带有 含MCS
24、序列的lacZ基因),外源DNA不宜大于1500 bp。,pBluescript KS（+/-）是一类从pUC载体派生而来的噬菌粒载体。,当RF型M13在细菌内达到100200个拷贝后，M13只合成单链DNA，并包装成噬菌体颗粒分泌到细胞外。可用于DNA测序、体外定点突变和核酸杂交。,*,52,（三）M13噬菌体载体 M13噬菌体基因组为闭环单,pBluescript SK（+/-）噬菌粒载体的分子结构示意图。SK表示多克隆位点区的一种取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向转录；（+/-）表示单链噬菌体f1复制起点的两种相反的取向。,pBluescript SK（+/-）噬菌粒载体的
25、分子结,三、人工染色体载体（自习）,酵母人工染色体载体，简称YAC载体，由酵母染色体、酵母2mDNA质粒的复制起始序列等元件衍生而成；可插入100kb2,000kb外源DNA片段，是人类基因组计划中物理图谱绘制采用的主要载体。,细菌人工染色体载体，简称BAC载体，以细菌F因子为基础构建而成；可插入100kb300kb外源DNA片段，是人类基因组计划中序列分析采用的主要载体。,*,54,三、人工染色体载体（自习）酵母人工染色体载体,YAC结构图及基因克隆过程,*,55,YAC结构图及基因克隆过程*55,常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：,逆转录病毒(retrovirus,RV)慢病毒(len
26、tivirus):也属于RV家族,常用于构建载体的DNA病毒（游离型）：,腺病毒(adenovirus,Ad)腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus,EBV)痘苗病毒(vaccinia virus),四、病毒载体（自习）,*,56,常用于构建载体的RNA病毒（整合型）：逆转录病毒(retro,第四节目的基因的获得和体外重组Target DNA Acquirement and Recombinant In Vitro,*,57,第四节目的基因的获得和体外
27、重组Target DNA A,一、目的基因的获取分,（一）化学合成法 要求已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,（二）PCR或RT-PCR 要求已知目的基因的全序列或基因片段两侧的DNA序列。,（三）从基因组文库中筛选 DNA文库(genomic DNA library)cDNA文库(cDNA library),*,58,思考题 4,一、目的基因的获取分（一）化学合成法（二）PCR或R,（一）化学合成法,*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,*,59,*避免使用稀缺密码子，及宿主细胞的密码偏好。,（一）化学合成法*已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,反转录,AAnA,TTnT 5,
28、5,mRNA,反转录酶,mRNA,cDNA,3,TTnT,AAnA,核糖核酸酶H,TTnT,3,DNA poly I,cDNA,核酸酶S1,双链cDNA,3,5,3,5,5,加热变性,加入特异性引物,DNA聚合酶,重复上述步骤,扩增出大量的产物,聚合酶链式反应,退火,延伸,（二）PCR或RTPCR,反转录AAnATTnT 55mRNA反转录酶mRNAc,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组DNA分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有gDNA的集合。,1.gDNA文库构建,（三）从基因文库中筛选,*,61,EMBL
29、3/4系列噬菌体载体(置换型，适用于基因组DNA文库构建),组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组D,限制酶切位点,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,EMBL3/4系列(置换型，适用于基因组DNA文库构建),*,62,限制酶切位点限制酶消化 除去中间片段cos LR cosc,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组cDNA分子,反转录酶,载体,受体菌,复制,2.cDNA文库的构建,cDNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有cDNA的集合。,*,63,含重组cDNA分子的转化菌,gt10
30、/11系列噬菌体载体(插入型，适用于cDNA文库构建),mRNA cDNA 双链cDNA 重组cDNA分子,限制酶切位点,限制酶消化,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体感染大肠杆菌,7 Kb DNA 片段,gt10/11系列(插入型，适用于cDNA克隆),c DNA 片段,*,64,限制酶切位点限制酶消化 cos LR coscos LR,gDNA文库：g-文库,cDNA文库：c-文库,方法：,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,3.从基因文库中筛选目的基因,*,65,gDNA文库：g-文
31、库cDNA文库：c-文库方法：用,Screening a genomic library by colony hybridization.,Screening a genomic library by,Bam H切割反应,GGATCC CCTAGG,T4 DNA连接酶，15C,二、目的基因的体外重组接,（一）黏性末端连接,1.同一限制酶切位点连,Bam H切割反应 GGATCCT4 DNA连接酶，15,Eco R切割位点,Bg l切割位点,2.不同限制酶切位点连,*,68,Eco R切割位点Bg l切割位点+EcoR+Bg,目的基因,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶，15C,（二
32、）平末端连接,*,69,目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶，15,Eco R,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,(三）人工接头(linker)连接,*,70,Eco RCCGAATTCG 5-Eco R由平端加上,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+dATP,末端转移酶+dTTP,（四）同聚物加尾连接,*,71,53载体DNA53目的基因限制酶或机械剪切限制酶,PCR扩增,+,连接,转化,蓝白筛选,Taq酶,(五）T-A克隆,*,72,PCR扩增+335PCR产物AA5T载体TT55,*
33、,73,Inporting,Screening and Verification of Recombinant DNA,第五节重组DNA分子的导入和筛选与鉴定,*73Inporting,Screening and Ve,一、重组DNA分子的导入 转,宿主细胞应具备的特征：,处于感受态,对载体无严格限制,限制酶和重组酶缺陷,不对外源DNA进行修饰,能表达重组体所提供表型特征,将体外构建的重组DNA分子导入用于复制、扩增和表达的原核或真核受体细胞。,*,74,一、重组DNA分子的导入 转宿主细胞应具备的特征：,（一）转化(transformation)指将质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导
34、入细菌（原核细胞）的过程。如大肠杆菌K12突变株低渗CaCl2,0处理进入感受态。,（二）转染(transfection)指将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的重组DNA 分子导入真核细胞的过程。,（三）感染(infection)指以人工改造的噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA，经体外包装成具有感染性的噬菌体或病毒颗粒后，通过感染宿主细胞而借助外壳蛋白将重组DNA注入到细菌或真核细胞内复制扩增的过程。,*,75,（一）转化(transformation)（二）转染(tra,1.磷酸钙介导的转染2.DEAE-葡聚糖介导的转染3.电穿孔转染4.脂质体转染5.显微注射,（二）转染(transfecti
35、on),*,76,思考题 5,1.磷酸钙介导的转染（二）转染*76思考题 5,非转化子(不能生长）,1.根据载体的耐药性标记（初步）筛选,（一）根据重组载体的遗传表型进行筛选,二、重组DNA分子的筛选与鉴定 筛,*,77,非转化子(不能生长）单抗生素筛选转化子阳性重组子1.根据载,2.根据载体的耐药性标记插入失活选择,例：载体中的Tetr基因被目的基因插入而失去活性，不能表达抗Tet蛋白，故细菌不能在含Tet的培养基中存活。,*,78,2.根据载体的耐药性标记插入失活选择例：载体中的Tetr基因,A typical bacterial transformation experiment.,A
36、typical bacterial transforma,互补的检测,3.根据-半乳糖苷酶显色反应筛选,互补的检测3.根据-半乳糖苷酶显色反应筛选,标志补救,4.根据筛选插入的外源基因的性状进行筛选,*,81,-核酸外切酶,组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷促进组氨酸,(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定,(四)PCR,(三)核酸分子杂交法,是从基因文库中挑选含有目的基因的阳性克隆的常用方法。,根据MCS两侧的保守序列设计引物，对提取的重组载体进行PCR扩增鉴定，并可直接进行测序。,*,82,(五)免疫化学检测法,利用特异性抗体与目的基因表达的蛋白质相互结合通过放射免疫、化学发光来筛
37、选转化菌。,用插入点的限制酶酶切重组DNA，行琼脂糖凝胶电泳，根据是不有目的基因和载体的泳带来判断重组成功与否。,(二)限制性内切酶酶切电泳鉴定(四)PCR(三)核酸分,重组DNA技术操作的主要步骤,载体,目的基因（外源基因）,*,83,重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源,*,84,Exogenous Gene Expression,第六节外源基因的表达,*84Exogenous Gene Expression第六,表达体系的建立包括：,外源基因表达涉及目的基因的克隆、扩增，转录、翻译，蛋白质产物的加工修饰，以及分离、纯化等过程，需要在适合的表达系统中完成。,表达系统
38、可根据受体细胞的不同分为原核表达系统和真核表达系统。,*,85,思考题 6,表达载体的构建；受体细胞的建立；表达产物的分离、纯化等技术和策略。,表达体系的建立包括：外源基因表达涉及目的基因的克隆、,重组DNA医药产品,产 品功 能组织型纤溶酶原激活物抗凝血液因子VI,一、外源基因在原核系统中的表达,-大肠杆菌（E.coli）表达体系最常用,优点:,*,87,（一）优缺点,培养简单、迅速、经济而又适合大规模生产。,只适于表达克隆的cDNA，不适于真核基因组DNA；,真核蛋白常不能形成正确的折叠和修饰；,真核蛋白常以无生物活性的包含体形式存在；,难以实现大量分泌性蛋白的表达；,真核蛋白不稳定，易被
39、细菌蛋白酶降解；,原核细胞周质中常含有种类繁多的内毒素。,缺点:,一、外源基因在原核系统中的表达-大肠杆菌（,（二）对外源目的基因的要求,外源真核基因不能带有5端非编码区和内含子结 构，必须用cDNA或化学合成基因；,外源基因必须置于原核细胞的强启动子和SD序列 等元件控制下；,重组载体必须形成正确的开放阅读框架；,外源基因转录生成的mRNA必须相对稳定并能被有 效翻译，所表达的蛋白质产物稳定且对宿主菌不 能有毒害作用。,*,88,（二）对外源目的基因的要求 外源真核基因不能带有5端非,（三）对原核表达载体的要求,具有强启动子及其两侧的调控序列，能调控基 因的转录，产生大量mRNA；,含有SD
40、序列，而且SD序列与起始密码子AUG之间 的距离要有合适,带有转录终止序列：如在下游加入不依赖因 子的转录终止区,含多接头克隆位点PCS，以利于外源基因插入。,*,89,（三）对原核表达载体的要求 具有强启动子及其两侧的调控序,（四）外源基因在原核细胞中的表达方式,融合型表达蛋白：将外源目的基因与另一基因拼 接成融合基因，表达融合蛋白(fusion protein)。,非融合型表达:外源目的基因不与其他基因融合，直接从起始密码AUG开始在原核调控元件控制下 表达蛋白质。,分泌型表达：将外源目的基因与信号肽编码序列 拼接成融合基因的表达方式。,*包含体(inclusion body)：高效表达时
41、蛋白质致密地集聚在细胞内形成的一种水不溶性结构。,*,90,（四）外源基因在原核细胞中的表达方式 融合型表达蛋白：将,二、外源基因在真核细胞中的表达,真核表达系统是指在真核细胞中表达外源基因的体系。,*,91,主要有酵母表达系统、哺乳动物系统、昆虫细胞（杆状病毒）和高等植物系统。,二、外源基因在真核细胞中的表达 真核表达系统是指在,（一）真核表达系统的优缺点,优点：,可表达克隆的cDNA或真核基因组DNA；,可进行糖基化、磷酸化、乙酰化等修饰，使表达蛋白形成正确的天然构象；,某些真核细胞可将外源基因表达产物直接 分泌至细胞培养基中。,缺点：,操作技术难、费时、费钱。,*,92,（一）真核表达系
42、统的优缺点优点：可表达克隆的,含有原核克隆载体的复制子、抗性筛选基因和 MCS等序列；,含有真核细胞的启动子、增强子、剪接信号、转录终止信号和PolyA化信号及遗传选择标记 等组件。,*,93,（二）真核表达载体 大,（三）外源基因导入和转染细胞的筛选,1.导入真核细胞的方法 病毒感染（天然方法）载体转染（化学或物理方法）,2.常用的筛选方法有 新霉素抗性选择系统 胸苷激酶基因HAT选择系统 二氢叶酸还原酶基因选择系统,*,94,（三）外源基因导入和转染细胞的筛选1.导入真核细胞的方法,（四）外源基因在真核细胞中的表达,瞬时表达（不与宿主染色体整合）常用的瞬时表达宿主是来源于非洲绿猴肾CV-1
43、细胞的COS细胞。,稳定表达（整合至宿主染色体中）常用的稳定表达宿主细胞是来源于中国仓鼠卵巢的CHO细胞。,*,95,（四）外源基因在真核细胞中的表达瞬时表达（不与宿主染色体,*,96,第七节重组DNA技术的应用,Application of recombinant DNA technique,自习,*96第七节重组DNA技术的应用Application,重组DNA技术的主要应用,(1)克隆目的基因，研究疾病相关基因的结构与功能，表达具有生物学活性的蛋白质；,(2)利用定点突变技术，研究蛋白质的结构与功能，或对蛋白质进行结构改造；,(4)开发基因工程药物与疫苗用于疾病治疗；,(3)利用转基因技术和基因剔除技术研究基因功能，建立转基因动物模型；,(5)建立基因诊断、鉴定与基因治疗的新方法。,重组DNA技术的主要应用(1)克隆目的基因，研究疾,学习要求,1.掌握重组 DNA 技术的相关概念、基本原理和主要步骤。(ppt3),5.熟悉重组体导入受体细胞及筛选方法。(ppt74),2.掌握限制性内切酶概念及作用特点。(ppt9),3.熟悉常用载体及特点。(ppt35),4.熟悉目的基因获取及与载体连接的方法。(ppt57),6.了解基因克隆表达技术，原核、真核表达系统的优缺点。(ppt86),学习要求 1.掌握重组 DNA 技术的相关概念、基本原,
