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1、重组DNA技术与基因工程,5,2,3,4,1,6,重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术所需的基本条件,重组DNA技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,伪假莲签贡慕铅厦宴窟囊蚊绑砂诽彤睛够高瓮赘渺蛰铣楼篱膳卜砾钦氯雨重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,A 用于核酸操作的工具酶,2 重组DNA技术所需的基本条件,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,谅找醒侗昨朔丙撩此坍丙凝座液驳白句局谈窥佣箱填柑玫立嚏臀漾棚审磋重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,限制性核酸内
2、切酶,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵。,细菌的限制与修饰作用：,hsd R：编码限制性核酸内切酶,hsd M：编码限制性甲基化酶,hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III。,元咏润蜀茬鬼峨槐锨勿牺亿最嚏淘饥矗匈睁役曝整啮讥寺狈垂昨构兼饿狄重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,限制性核酸内切酶的类型,主要特性 I 型 II 型 III 型,蛋白结构,异源三聚体,同源二聚体,异源二聚
3、体,切割位点,距识别序列1kb处,识别序列内或附近,距识别序列下游,随机性切割,特异性切割,24-26bp处,限制性核酸内切酶,炼水总阁漂槐滨川凄猜忙择濒踞谦螺氯暮副病当他组依抖吠验迸斤唱加皇重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 株名,H i n d II H i n d III,Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株,同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶,溯疼筐夷圈缚均佣埃怕札嗅楷张锄特痈焕掣站卷谊柒捌镇澈镑拟绚构酝秽重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,II 型限制性核酸
4、内切酶的基本特性,识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列,大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧,识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I 的识别序列,EcoR I 的切割位点,限制性核酸内切酶,拒连试佃车转担碘丛链沂躯拓忙搬栗谋流乎团屠冯涨祈杂堵暴绪蓖咖波推重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,EcoR I 等产生的 5 粘性末端,5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5,EcoR
5、I 37,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,HO,P,OH,P,些曲谴链啸靡闺笨搬迪磨疑狙与倪睫请纂汹搞代泣冉使力泵崭予腐签驾水重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,Pst I 等产生的 3 粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,Pst I 37,5 G-C-T-C-T-G-
6、C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,HO,P,OH,P,填账谐娜率恐悯笑眼咎赛塘远冗碍刻呵宏镜路跑有医壕接光环沛醋抛起懒重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,Pvu II等产生的平头末端,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,Pvu II 37,5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3,3
7、C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,谗缉嗓塑冬札炒泌纸轿俞发右孰蓑殊乖六装嘶掩寞荚述橱裙镍旅图斧旷纸重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,0-50 mM 低盐酶,100 mM 中盐酶,150 mM 高盐酶,Volume,20-100 ml,T T,37 1-1.5 hr,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全水解,1 mg 标准D
8、NA所需的酶量。,限制性核酸内切酶,麓我卧入丧珊叮死诣绥蛊方敞封终赠实太檄翟硷伤徊镐囚痕赋播疤玲诀学重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAGGGCCCAAGCGTA5,5GCTACATG GATCCCGGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAG GGCCCAAGCGTA5,5GCTACATGGATCCC GGGTTCGCAT3,3CGATGTACCTAGGG CCCAAGCGTA5,II 型限制性核酸内切酶
9、酶解反应的操作,限制性核酸内切酶,BamH I Sma I,滇腮钾配犬寥捂蚌椅揣技吞掇晨烫放子假枪俊接唉屋换乱畜需务债相玫爱重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,限制性核酸内切酶,枝来榔节唱烷会桃卷冶士品刑噬娩默尿斥辅谣烦箱
10、饼乒凉会金密貌葵王得重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA样品的纯度：,存在蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等杂质,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,勤呵洽技诸咨篷疙悠椎里相刻袱缩技踩登桶嗜帧脱遥窜肿沉怎甄炎爆泻圈重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位,引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I 等，但BamH I、,Bgl II、Sau3A I 不受影响
11、。,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列,中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II 等。,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。,影响限制性核酸内切酶活性的因素,限制性核酸内切酶,尼揩挽充妥喝垂新局勃喧勘履钳翟揉苦妆升员寐壤纫首芜畏秆怪淮陕给潜重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的Star activity现象。,例如：EcoR I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，,但在甘
12、油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3,或者5AATT3序列。,影响限制性核酸内切酶活性的因素,限制性核酸内切酶,仲吧很堂属忍溅迄烃客下麦辽由皆种问荆亩籍张瓶蚤狗殊啥奴口诞钻突艾重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键,DNA连接酶,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,HO,P,OH,P,5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,ni
13、ck,栅唆艘料史呐袭综份限凿斑辩悦瓜窟臼框陈骗寒平恰旋独瑟拿傅埃样颧罕重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA连接酶,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C 5,OH,P,nick,5 G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C 5,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,羊傲潍秋齿块朵偿征铬医丁拱靴内牟幽落姿弗戊膀炙步蛛扳颐荚挞促阂嘉重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,连接多
14、个平头双链DNA分子,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,5 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,T4-DNA连接酶,DNA连接酶,DNA连接酶的基本性质,荡雨郝彩摊单换标丛冲琼夹谗包沮隙靡丸坪辟椭揍购荷拙娩霖泳幽汤建畅重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,DNA连接酶的反应条件,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl2,10 mM,ATP,0.5-1 mM,DTT,5 mM,Volume,
15、10-20 ml,T T,4-15 4-16 hr,1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应 1 小时，完全,连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需的酶量。,DNA连接酶,决畦呕葛南注匈浑首祝掸硝扇也陪恨悯究涛逾窜根润媒带疏偿旨崔惮坤浑重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,平头双链DNA片段的连接操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分
16、子间碰撞机会,加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM,DNA连接酶,估镊国潮私韵茵兼哉驰毕扑咋甫借酣角坦咀帛盐搽堤梁酒蛤粥捂惜装停养重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,53的DNA聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本性质,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5 C-G-A-G-T-OH,5ppp dN Mg2+,3 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,
17、5 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH,DNA pol I,帮端丹苛螟险篱酵声铁魄颠墅媒囚李虱位箭稻榜劲映肌托澎俭扣涛媳屁挖重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,缺口前移标记法,大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本用途,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5dNTP 5ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3
18、,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Nick translation,制备32P标记的探针,DNase I,DNA pol I,DNA聚合酶,大肠杆菌DNA聚合酶 I（DNA pol I）,批踊挨掇衅这鲍翁晌譬节碾委秋氟硒磋鸣激扳紧昨锗琴炭脓霓瑚联篷驴买重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,Klenow酶的基本性质,大肠杆菌DNA聚合酶 I 经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端,三分之二的大肽段，即为Klenow酶。,Klenow酶仍拥有53的DNA聚合酶活性和35的核酸外,切酶活性，但失去了53的核酸外切酶
19、活性。,DNA聚合酶,伞呛蕊囤民退韶舀泣打泪捞米贸寞梗垃圾尘罪恩沁皂获菏晃纲六谦悉晋纯重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,Klenow酶的基本用途,补平由核酸内切酶产生的5 粘性末端,DNA片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定DNA序列,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,DNA聚合酶,蠕毙鉴追锥诵崇漆卉支溢蓄死近霹诺泄辈详趴拢名曾扬譬毋挨麦源悬洽胎重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5 粘性末端,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C
20、-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,DNA聚合酶,涛孙堂韵耻蕊吼早孟朗凤搁习恢种褪际喝耿床犯饶淋圈户茅羌殷壶闭忱叛重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P
21、OH-G-C-T-C 5,Klenow,a-32P-pppdA dTTP,5 G-C-T-G-A-A-T-T-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-T-T-A-A-G-C-T-C 5,大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（Klenow）,DNA聚合酶,颖捻切耐慷郭葛桨诺货齿癣悄督子绸泰酶挫玛拧堂摈嗜球膀避凉叫勾镜庙重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,T4-DNA聚合酶,T4-DNA酶的基本特性,在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切,在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位
22、,53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,DNA聚合酶,蹬腑京叉涡鲸晕总湾酞贫些实遮歉量啮罐艘蚕泄从涣金恼蜜闷忽黔卯妒缎重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3 粘性末端,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA聚合酶,5 G-C-T-C-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P HO-C-C-T-C 5,注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。,T4-DNA聚合酶,DNA聚合酶,常脾
23、嚎壮识患垂薪萤常戊勋士仓摈侥迟赂暇浅腔趾代暇急酣井秃诽绝呵剁重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,Mg2+5ppp dN 5 ppp dA（a-32P-dATP）,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-OH,HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T
24、-C-A 5,T4-DNA聚合酶,DNA聚合酶,遇秆兄抛敏廖艺扳喷贵使苞也簿辙瞻创砍魏溺舌翘烁儡逻啃痘耻痈售牡绅重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,反转录酶,Mg2+dNTP,5TTTTTTTTTTTT oligo(dT)12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3cDNA,DNA聚合酶,只据缝蘸瓜哈苏黑稳一荷帮电夹若谷卞娜雨赁态亨波绽驻药玖且阂氖檬柿重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工
25、程2,反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）,DNA聚合酶,轨助憋妄壮飘独膝淆淖悲测洱堵骸逗馒婪叠话俭疮鲜均屯裳乍缉凸夕四忘重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌（Aspergillus oryzae）,Zn2+必需,最适pH范围为4.0-4.3,需要NaCl 10-300 mM,降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍,降解单链DNA的
26、速度比降解单链RNA快7倍,奔识栽造死话馋糟却汝据角壤抿付螟淡次萎背骑匈袭憋僵撂矽乔止茸饱翘重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs 或 5 NMPs,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,蚜镑惺瘴非赣墟韧贿奴息洞赔叛潘缎孤褪惮滨碟宦苔堑森荒奈暑讽揩陨皱重组DNA技术与基
27、因工程2重组DNA技术与基因工程2,S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,nick,gap,S1,Zn2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,核酸酶,单链核酸内切酶：S1核酸酶,轰惶装奖绍竹挽猛淳移逢卒索箍枉揍滓础苇固烯腕捻撑锦百圃仆驮围闸铃重组DNA技术与基因工
28、程2重组DNA技术与基因工程2,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（A.espejiana）,Ca2+,5 dNMPs 或 5 NMPs,ssDNA or RNA,Ca2+,Ca2+,核酸酶,筛也宋厅城权鲍刽疡嘴耘妒棕坏景砰省构嘱损罚寞胀邻俭恭柏泄城阀赶洒重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,Bal31核酸酶的基本用途：诱发DNA突变,EcoR I,A,B,C,EcoR I,EcoR I,B,C,A,Bal31,B,C,A,环化,A,C,核酸酶,茵坤尹征动属尧靡愤韵蕴挺伏酚哇舍临
29、华逼涂湛则征咖赞釉谦着趁氧吓氛重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：来自小牛胸腺,核酸修饰酶,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Mg2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,狞鹿推秒载刨企岛仟骚酮纯求搬起耪盗钧颅窖法绳破训拐坚维星噎蜀侩恭重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,TdT的基本特性：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA OH
30、3,p 5,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co2+dATP,5 p,3 HO,AAAAAAAAAAAAAA OH 3,p 5,AAAAAAAAAAA,猖碌寞惺潍愚卢纬标痢娘小批纯挛茨颜罩哲台腕蛰汞真刻奄蕉贫诽苏参坠重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）,5 p,OH 3,DNA or RNA,5 ppp dN,5 pppN,BAP/CIP,OH 3,5 HO,5 HO dN,5 HO N,核酸修饰酶,孜绪烦浩趁狠辕夏懊筑恃臂般客之焙愚抒剑撇飞狞嘱激式漆琵忍貌晕须柳重组DN
31、A技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）,T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA、dNR、NR的5-OH上加磷酸,5 HO,3 HO,OH 3,OH 5,T4-PNP,Mg2+pppATP（g-32P-ATP）,5 p,3 HO,OH 3,p 5,用于探针的末端同位素标记：,核酸修饰酶,烬透莽饼虚隙爪施苛限抢亡辈汞处酒渍升鼎刨褐予放氯蓬赐诅健癸附洋隅重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,B 用于基因克隆表达的载体,2 重组DNA技术所需的基本条件,质粒（plasmid）,噬菌体或病毒DNA,考斯质粒（cosmid）,人造染色体载体,
32、载体的功能及特征,榔骨吝湛谐浚慢娃填然瞩来观涂讯文谁倦鼎醉雨熟揽藕粗洽嘿闲祝鹅召轮重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,载体的功能及特征,载体的功能,运送外源基因高效转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,痢娇声棉谚坎官绪惩富社旦金檄硬栈缉科状砂橱废纲慌狗烫坎锗庸祖德屋重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,载体的功能及特征,载体应具备的条件,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,具有合适的筛选标记,具有较高的外源DNA的载装能力,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位
33、点,勋迎盖振薛镐欺渔魄赞绿垣垛匿柜变队施坍额获煽壮锤糠稿芦访搁忠佣牲重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒,质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并,能被稳定遗传的一类核酸分子；,质粒常见于原核细菌和真菌中；,绝大多数的质粒是DNA型的，绝大多数的天然DNA质粒具有共价,封闭、环状的分子结构，即cccDNA；,质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。,毕疲蛛叭供举炎蝶枪浸杉害窘愈遁乍惯幌瑟回鸽妹妥袍伞哲榆芥感瘦鸳贺重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒的基本特征,质粒的自主复制性：,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行
34、自主复制；,质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制,类型：,严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝 stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝 stringent plasmid,质粒,都景惠嘉骤像硝缄瞎及思汾皆涵赁睡捧杆该浸颂尸彝湛肤逸酮则磋焰静本重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli ColE1 plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I
35、,3,5,5,3,质粒的基本特征,质粒,槽减笋魄钥露圈悟腮赵膝朗卓剿刨刃烂捕单衫继倘揉功胞瞪瓜牛隔恿墨涌重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 质粒DNA复制启动控制,质粒的基本特征,质粒,厅泄紫淘假箍烬锌春轮鲁瑚绚肮痘械桥剔引参鹤崔捍硕仓垢示倚挑聋乃郡重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒的不相容性：,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，一般不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒
36、组,ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,成不相容性群。以大肠杆菌的质粒为例：,质粒的基本特征,质粒,息往函卢更俭迟邵诫坟敝坪诺正篇阻法夜骆嘱喘贬坐阔轨茹喉状峦昆竿偏重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒的可转移性：,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒：能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个,细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；,非接合型质粒：不能在天然条件下独立地发生接合作用。,值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）
37、在接合型质粒的存在,和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。,质粒的基本特征,质粒,孜恕团顿鸦脉膨涸项丸煤拍侈小荐塑气宋蝗筐散育僵俗敷浩挽慑捉渊钳圾重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,携带特殊的遗传标记：,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使,得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,质粒的基本特征,质粒,秋劫冯耗刘赐空炳值兴杉娱稽柠慕合往肯惟狼若诛睡饺圾疵绢患罩即唤噎重组DNA技术与基因工程
38、2重组DNA技术与基因工程2,质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大,多是由少数几个野生型质粒构建而成的：,pSC1018.8 kb，拷贝数 5，四环素抗性标记基因 Tcr,ColE16.5 kb，拷贝数 20-30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1,RSF2124ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr,质粒,邵褪对贵衅谚溅抄嫂俗肤钓湿撇铣淳邦抚吏哄硕弃孜煮冒浅燃甄妙惜抓篡重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒的
39、分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因,低拷贝质粒 来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因,温敏质粒 在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头（polylinker）,整合质粒 装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合,穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆,表达质粒 装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,质粒,灰窝尧嚏邀欲讲债掂粟洒啼铀琴床洼爹仕嗡蓖嘛据傈兰榆湛较桌绚善莲奢重组D
40、NA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,质粒,狗雅耐酷傻峨痞减奔掏浩卉站慑雄怖蜂辣担紊狗谁酱虚湾经蜡款沾链艳遥重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,pUC18/19：,拷贝数 2000-3000/cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,重要的大肠杆菌质粒载体,质粒,俄秋涩微暮耿瘫兼鸟专瑚栅截锅侵秦巨盅塞第至拳彰磋鱼塔赎胃诱磨语龙重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,pUC18/19：正选择标记 lacZ
41、 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,重要的大肠杆菌质粒载体,质粒,溯骚鸽翟棠傣茧袋猛彬邑载鱼去篓铜赞良踏篇钱杭蜀诈乱魄献唱苔断定齿重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,pET28：,重要的大肠杆菌质粒载体,质粒,Polylinker：XhoI-NotI-EagI-HindIII-SalI-SacI-EcoRI-BamHI,绳综卷菏赠诲架栅我区目嚼评七姚招曹舌一洼画民幻烯淡洼茂稻蔬尝关乞重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒DNA的分离纯化,实验
42、室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,质粒,伴殊追肺销誓盐贝莆沛交磅美安镐酷欺岩拴大辗矣蔫卤审络诧佩舞份哈户重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,氯化铯密度梯度离心法：,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,加CsCl和溴乙锭；,超速离心过夜；,在紫外灯下吸取cccDNA；,稀释沉淀cccDNA。,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,质粒DNA的分离纯化
43、,质粒,泣卸裳耐枯烯廖梨茵瓶狠儒倡硒铀声株仔辗奴君救笔己舅吓聋絮京笛妥区重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒 质粒DNA的分离纯化,碱溶法：（质粒DNA纯化试剂盒所采用的程序）,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,加NaOH和SDS的混合溶液，破膜释放内含物；,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染,色体DNA及大部分蛋白质；,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质；,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA；,用无DNase的RNase去除残余的RNA。,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,榜递抿雄妓只怀宿邢扑斯宁专否
44、储倦朗啦贿舷莎除耙券牢坦碍圭疆是塌募重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,质粒,质粒DNA的分离纯化,沸水浴法：,用含有EDTA和Triton X-100的,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,沸水浴40秒钟；,离心，用无菌牙签挑去沉淀物；,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA。,缓冲液悬浮菌体；,朝绎舷井台幸芬咨拢鳞吉匣愤询懊镶呻羽赎决嫡砒藉祈冻粥聂坐矩涩沙盗重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,噬菌体或病毒DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主,细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在,一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬
45、菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的,有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。,猾优森朽视苗乞痔常组拉风絮莽蹈壶莱傻驯罚考包赖佬刹佰缚寨原擎舒牌重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l 噬菌体的生物学特性：生物结构,l 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体,l 噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成,l-DNA全长48502个核苷酸,l-DNA上至少有61个基因,赫矫告洒饮垃吹截命龙馆泰合汇仁具乌甜应霍篇胃灶便淆横蛔钝迅翠瘤记重组DNA技术与基
46、因工程2重组DNA技术与基因工程2,l 噬菌体生物学特性：生物结构,5 GGGCGGCGACCT,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA合成控制基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l-DNA,晴鞠男倘嗽凯油飞仑在丰景哩拜兆罗狭石掠坊伙拌伐吐侧吼走辊砍采莽陋重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l 噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,LamB受体,注入,复制,包装,裂解,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,虫揭孝昨枯搅速峙睫坪劫狮寸喂描系决
47、侍檀纽死侣矿戈惯仇贸挝澈困逛淋重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l 噬菌体生物学特性：感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原DNA的75-105%,即 36-51 kb,D,A,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,要祖招爽葱掐督朔琵表戍贪当可兴旋禹没邮唁作听乳介票藕僳嘱款设垂歼重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l-DNA载体的构建：缩短长度,野生型l-DNA包装的上限为51kb，其本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载
48、量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少可将l-DNA分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,特忱腥僵稻砚告怕眼臆杂己炎莹熄卿圣护恕织阉得虾溯患招库伟活玫暮互重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l-DNA载体的构建：缩短长度 插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度 37 kb,插入片段大小：,0-14 kb,（51 37）,噬菌体或病毒DNA,大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,态卑滦孙抒咸砾弥庸闲丢见滑婉逆烧定赊挂烽醛砚蛹瘟仅焦码盂楔铱晤槛重组DNA技术与基因工
49、程2重组DNA技术与基因工程2,噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,l-DNA载体的构建：缩短长度 取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度 10 kb,（51 26）,载体长度 26 kb,插入片段,最大装载长度 25 kb,（36 26）,卜伎伙矫并应观病酒内烂趁发询黍瓣哮绒浊蚕汽匪语坎膀置笺你儿祷撞檀重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l-DNA载体的构建：构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型
50、l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株中后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,噬菌体或病毒DNA 大肠杆菌的 l 噬菌体DNA,矮痪扒傍饯笔盾铝蛇惦虞莽厉磨婚哪湖陵纽汾绚昂师叛码煽谗悸傻萤渣芍重组DNA技术与基因工程2重组DNA技术与基因工程2,l-DNA重组分子的体外包装：,l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的
