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1、分子印迹聚合物简介,主要内容,一、分子印迹基础知识二、文献介绍三、最近实验情况,一、分子印迹基础知识,1、分子印迹技术 分子印迹技术是当前发展高选择性材料的主要方法之一，其原理是模仿自然界抗原-抗体反应机理，在聚合物材料中引入分子识别位点，制备在空间和结合位点上与特定目标分子相匹配的、具有特定预定选择性的高分子化合物分子印迹聚合物。,2、分子印迹技术基本原理 分子印迹就是将模板分子与功能单体通过共价、非共价或金属协同作用形成预聚合物，在交联剂的作用下功能单体发生聚合，将模板分子固定在聚合物中，最后脱除模板分子，即聚合物材料上留下与模板分子在大小、形状和官能团的方向上都互补的空穴结构。空穴不仅保
2、留了与模板分子化学结构互补的官能团的有序排列，也维持了它的整个空间构象，所以当材料再次遇到模板分子时，可发生特异性的结合。,3、分子印迹聚合物制备方法,3.1 整体印迹 将印迹分子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂中，然后移入一玻璃安培瓶中，采用超声波脱气，然后通入氮气以除氧，在真空下密封安培瓶，经加热或紫外光照射引发聚合得到块状聚合物。块状聚合物经粉碎、研磨、筛选等过程获得合适大小的粒子，洗脱除去模板分子。Hawkin等以异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的白蛋白为模板蛋白,丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺分别为功能单体和交
3、联剂,用整体印迹法制备印迹材料。共聚焦显微镜图片显示,标记了荧光的模板蛋白均匀分布于分子印迹凝胶骨架材料中,材料经10%十二烷基硫酸钠(sodiu dodecylsulfate,SDS)/10%醋酸溶液洗涤后荧光消失，证明SDS溶液可以使印迹蛋白变性并将其脱除。Ye等设计了新型功能单体，可以通过金属协同作用与模板蛋白的特定氨基酸序列结合，以此构造更均一的结合位点，并在一定程度上减少非特异性吸附。N-(4-乙烯基）-苯甲基亚胺基双醋酸（N-（4-vinyl)-benzyl iminodiacetic acid,VBIDA)是一种金属螯合单体，它可与二价铜离子螯合作为桥梁，再通过铜离子与蛋白表面暴
4、露的组氨酸相互作用形成复合物。用EDTA将模板蛋白脱除，从而在材料上留下结合位点。,Qin等以溶菌酶为模板蛋白，N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺和VBIDA为功能单体，用冷冻聚合法制得印迹溶菌酶的热敏大孔水凝胶。这种智能水凝胶对模板蛋白表现出很强的吸附能力，印迹因子可达7.87，并在多种蛋白的混合溶液中对模板蛋白实现成功分离。,Brown等用溶胶-凝胶法制备无定形聚硅氧烷印迹材料，用无定形硅印迹溶菌酶多肽序列（16-residue peptide lysozyme C,1.8 kDa)识别位点实际就相当于识别整个分子，与传统的有机材料相比，首先小段多肽与单体材料有更强和更具特异性的相互作用，以此减
5、少非特异性吸附并增强材料对模板的亲和力，其次，小段多肽在有机试剂中相对稳定，因而其有机试剂也可作为聚合的介质对模板蛋白结合力强，选择性好，蛋白进出材料骨架速度快，此种方法相当于抗原决定基法。,整体印迹法工艺虽然简单，但后续处理复杂耗时，所得材料需经研磨和过筛才能得到所需粒径范围的颗粒，并不适合工业化生产。另外，此种方式制得的材料外形不规则，限制了其在色谱和固相萃取领域的应用。最重要的是，整体聚合时不可避免地会有大量的印迹位点分布于材料内部，不利于蛋白质的进出。,3.2 表面印迹 在聚合物的表面或近表面构造模板蛋白的结合位点称为“表面印迹”。与整体印迹旨在构造蛋白特异性三维结构不同的是，表面印迹
6、的特点是在材料的表面构建蛋白的“二维印迹”。这样的二维阴极材料从某种程度上解决了生物大分子难以进出聚合物材料的问题，可大大缩短蛋白扩散进入材料并达到平衡的时间。然而，与“三维印迹”材料性比，“二维印迹”材料可能会出现对模板蛋白选择性降低的问题。,El kirat 等首先对玻璃板进行硅烷化，用双功能交联剂将模板蛋白接枝与其上，继而在表面进行单体材料丙烯酰胺的聚合，由此制得二维结构印迹材料。该研究小组首次用AFM对材料进行表征。AFM对材料表面的局部图像显示，印迹薄膜上分布有许多与模板蛋白大小形状互补的小孔穴，而非印迹薄膜图像模糊，无明显凹痕。小组以细胞色素c为模板，并将模板蛋白细胞色素c共价结合
7、与AFM的探针上，借助力-距离曲线探测出其在纳米尺度的范围内与印迹材料的特异性结合力在8595pN之间。将非模板蛋白牛血清白蛋白共价结合与探针上作为对照，结果发现探针与印迹材料没有特异性相互作用。将连接了模板单板的探针与非印迹材料相互作用也得到同样地结果。证明模板与印迹位点具有特异性亲和力。,Su等选用甲基丙烯酸为功能单体，聚乙二醇400二甲基丙烯酸酯为交联剂，用微接触印迹法制备了卵清蛋白印迹薄膜。印迹薄膜的AFM图像显示，材料上分布有直径约34nm的空穴，材料经蛋白重结合后图像表明卵清蛋白以直径为3236nm的蛋白簇形式重结合与表面的空穴中。,生物分子相互作用分析(biomolecular
8、interaction analysis)中常使用一种基于表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)的生物传感分析技术。实验时先将一种生物分子固定于传感器芯片上,使与之相互作用的另一生物分子甚至是细胞、病毒等的溶液流经该芯片。当两者发生相互作用时,芯片表面溶液会发生折射率的改变,从而引起共振角的变化,可实现实时跟踪检测生物分子间结合与解离过程的变化及其相互作用的强弱,Li 等将高度交联的壳聚糖微球作为“核”通过可逆的席夫碱反应共价连接模板蛋白BSA，最后在此多糖-蛋白的界面上通过溶胶-凝胶过程覆盖一层聚硅氧烷的“壳”。用乙二酸破坏席夫碱从而将模板蛋白从“核
9、”上脱除，而“壳”上则将模板的大小、形状及空间构象保留下来。此法制备的微球表面具有较粗糙的多孔结构。扫描电镜图像显示，印迹微球表面形成大量分布均匀、网状连接的空穴。BET氮气吸附试验结果表明，作为支撑基质的壳聚糖微球BET表面积为41.25m2g-1平均孔径为8.7 nm。而“核-壳”型印迹微球的BET 表面积为48.65 m2g-1,平均孔径达43.2 nm。表面积和孔径的增加提示了印迹位点的形成。,Tan 等19用微乳液聚合法制备超顺磁性亚微粒。预先制备Fe3O4 磁性纳米粒,将功能单体甲基丙烯酸甲酯和交联剂乙二醇二甲基丙烯酸分散在油相中,用微乳液聚合法制备表面印迹核糖核酸酶A(ribon
10、uclease A,RNase A)的亚微粒。与非印迹材料相比,印迹材料在混合蛋白溶液中对模板蛋白有很好的选择性。,Tan 等以甲基丙烯酸甲酯为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸为交联剂,用微乳液(W/O/W 复乳)聚合法制备了印迹RNase A 的纳米粒。该法中使用了较高浓度的SDS 和聚乙烯醇作为乳化剂。作者认为,当两亲性的蛋白被加入预聚合微乳液后,蛋白会吸附于表面活性剂形成的胶束中并被分配到油-水两相的界面上。聚合反应引发后,蛋白便被“束缚”在胶束的表面了。研究表明,蛋白和表面活性剂的相互作用有助于蛋白停留在纳米粒表面,然而太剧烈的作用却会导致蛋白明显的构象变化,甚至变性,造成错误的印迹。,印
11、迹纳米粒 Hoshino 等用沉淀聚合法制备两亲性多肽蜂毒肽为模板的聚合物纳米粒。沉淀聚合法制备条件温和，材料聚合过程中无需有机试剂或加热过程。由于Mel具两亲性，倾向于停留在聚合物-水相的界面上，在此位点上，Mel既能辅助材料的聚合，又能在材料上创建与之互补的特异性结合位点，在一定程度上达到“表面印迹”的效果。,二 文献介绍,（一）、氨基硅球表面印迹牛血清白蛋白分离条件的初步探索 文献探讨了识别蛋白质分子过程中是何种作用力起主导作用。选择无机前驱体、氨基硅烷和烃基硅烷为功能单体，牛血清白蛋白为模板分子，牛血红蛋白和溶菌酶为竞争蛋白，采用固定模板蛋白表面印迹的方法在氨丙基衍生的硅球表面制备了溶
12、胶-凝胶的MIPs。,1、印迹聚合物对不同蛋白质分离选择性的评价,取M IPs和N IPs各0.1 g置于离心管中,分别加入1mL 0.5 g/L各蛋白质溶液(pH 7.0,0.01mo l/L磷酸盐缓冲液),室温下振荡吸附3 h。将离心管于离心机中4000 r/m in离心3m in后,取上层清液用紫外吸收法测定蛋白质的含量,根据吸附前后蛋白质浓度的变化、溶液体积和聚合物的质量计算吸附量(Q)。Q 定义为每单位质量(g)聚合物的吸附量:Q=(C0-C t)V/m(1)C0 为初始蛋白质浓度(g/L),C t 为上清液中蛋白质浓度(g/L),V 为蛋白质溶液体积(mL),m 为印迹聚合物质量(
13、g)。印迹聚合物对不同蛋白质分离选择性用印迹因子()和选择因子()来评价。定义为=QM IP/QN IP(2)QM IP和QN IP分别为印迹聚合物和非印迹聚合物对蛋白质的吸附容量。定义为:=模板蛋白/竞争蛋白(3)模板蛋白和/竞争蛋白分别为模板蛋白和竞争蛋白的印迹因子。,2、烃基硅烷单体的种类对MIP选择性的影响,分别比较了PTMOS、HTMOS、PhTMOS、OTMOS为单体的MIP 的分离选择性。单体PhTMOS主要以-作用和蛋白结合，而PTMOS、HTMOS及OTMOS是通过疏水力与模板分子作用。实验结果显示，无论以何种单体为材料制备的MIP都对模板蛋白具有选择性吸附，这说明无论是疏水
14、力还是-作用在识别蛋白中都有一定贡献。制备MIP的分离选择性的强弱顺序为OTMOSHTMOS PTMOS,这说明碳链的长度越长，疏水性越大，对模板的分离选择性就越强。然而当由众多弱作用力总体产生的强作用被几个强的结合点代替时MIP的特异性会降低。实验中，由PhTMOS制备的MIPs选择性优于PTMOS，但不如HTMOS和OTMOS制备的MIPs,说明疏水作用比-作用对MIPs特异性作用贡献大。原因可能有a.PhTMOS与蛋白质上的芳香族氨基酸发生-作用，而多数蛋白含有的芳香族氨基酸很少，对于含有上百个氨基酸的蛋白质来说，不可避免会造成一定程度的非特异性结合;b.-作用是一种短程作用力，只有在蛋
15、白质与MIPs近距离接触时才会产生；而疏水力无方向性，作用快速，对结合蛋白质这种体积庞大的分子更有利。,3、氨基硅烷单体种类对MIPs选择性的影响,APTMS同APTES做功能单体相比，对模板蛋白的印迹效果好，且对竞争蛋白的Q值小。溶胶凝胶是以硅原子为中心，经过双原子亲核取代反应形成的。在双原子亲核取代反应中，官能团-OC2H5同-OCH3相比反应活性更大，从而加速水解和缩聚步骤，使形成的溶胶凝胶MIP结构更规则，识别位点更有序。MIPs对模板分子的选择性和亲和性不仅是因为MIPs中含有可以进行专一反应的结合位点，更为重要的是功能单体在MIPs上形成了高度有序的结构。,4、硅烷单体的比例对MI
16、Ps吸附性能的影响,实验中选择烃基硅烷、氨基硅烷和无机前驱体四乙氧基硅烷(TEOS)3种单体。氨基硅烷主要通过氢键与模板蛋白作用,烃基硅烷主要通过疏水力与模板蛋白作用,通过优化二者的比例发挥疏水力和氢键的协同作用,产生对模板分子最好的特异性识别;并且在制备M IPs时加入15%TEOS,此功能单体起一定的交联作用,使制备过程形成极有规则又适宜结合模板蛋白的孔穴。实验考察了不同比例的氨基硅烷与烃基硅烷对模板蛋白QM IP的影响。结果显示,随着氨基硅烷比例的增加,模板蛋白的QM IP减小。这是因为氨基硅烷本身带有的氨基会与硅球表面的醛基反应形成亚胺键,阻止了模板蛋白与醛基的进一步结合,使得QM I
17、P减小;而随着烃基硅烷比例的增加,模板蛋白的QM IP逐渐增大,当二者之比为1.5/1时,QM IP达到最大值。综合考虑上面两种因素对于M IPs吸附性能的影响,在实验中选择烃基硅烷单体与氨基硅烷单体的比例为1.1,M IPs配方为OTMOS.APTES.TEOS摩尔比是 42.5：42.5：15。,5、合成条件的酸度(pH)对MIPs选择性的影响 当选择了适宜的硅烷单体类型,烃基硅烷、氨基硅烷的种类,及各单体间适宜的比例,又继续研究合成条件的酸度(pH)对M IPs选择性的影响。pH 分别为4.9,7.0,9.0时聚合物对模板蛋白BSA及竞争蛋白HB、Lysozym e吸附的柱状图。通过比较
18、不同pH下的竞争吸附实验可知,当pH=7.0时,模板蛋白与MIPs间的疏水力,氢键作用,静电力及印迹孔穴等的协同作用使得此时的吸附选择性最佳。,较高的pH 值加速溶胶-凝胶形成过程中水解和缩合步骤,增加二氧化硅粒子的溶解,同时还将导致粒子的去质子化程度增加和表面电荷的增多,从而延长了团聚和凝胶化过程。因此在高pH环境的溶胶凝胶体系中可以制得高孔隙率、大孔径及高比表面积的产物。,6.优化洗脱固定模板蛋白的方法 为了进一步改善制备的MIPs各方面性能,本实验将本体系与以溶胶-凝胶为材料印迹蛋白的相关工作进行比较。文献工作中同被固定的模板蛋白相比仅有少量的蛋白质(约15%)被洗脱,大量的识别位点没有
19、暴露出来,这大大限制了MIPs的吸附量及选择性。因此,有效地将固定的模板蛋白去除是改善本方法制备的MIPs性能的关键。键。,氨基硅球表面印迹牛血清白蛋白分离选择性优化条件的总结 由以上的实验可知,对于氨基硅球表面印迹牛血清白蛋白体系,选择烃基硅烷为OTMOS、氨基硅烷为APTES、无机前驱体为TEOS制备MIPs,它们的摩尔比为42.5：42.5：15,合成条件的酸度为pH 7.0,并采用0.1mo l/L NaOH与10%(V/V)HAc-10%(m/V)SDS联用的方法洗脱固定的模板蛋白,由此制备的M IPs的分离选择性能最佳。,本体系中采用溶胶.凝胶印迹蛋白质,MIPs与模板分子间主要通
20、过疏水力和氢键相互作用。疏水作用是一种非短程作用力,当模板蛋白与MIPs较远时就产生，众多疏水力的总体作用使模板蛋白逐渐靠近与模板分子表面形成互补的“印迹孔穴”。在模板蛋白进入“印迹孔穴”时会产生类似于抗体与抗原之间的“诱导契合”,这种“诱导契合”是蛋白质分子与印迹孔穴产生“近接触”的基础。随着“近接触”的发生,氢键、-作用等短程作用力才发挥作用,它们和疏水力协同产生强的整体作用力与模板蛋白结合,使得MIPs对模板蛋白质具有较高的分离选择性。竞争蛋白因大小和形状与模板蛋白质不同,与“印迹孔穴”的构象不匹配,无法产生“诱导契合”,也就不具备产生众多弱键协同作用所需的前提条件“近接触”,因而无法形
21、成整体强的结合作用,MIPs对其分离选择性就会比较低。同样NIPs因不具有可产生“诱导契合”的“印迹孔穴”,故对模板蛋白和竞争分子均无选择性吸附,相应也就不具备分子识别能力。,MIPs识别蛋白质机理的初步讨论,2、Composite of CdTe quantum dots and molecularly imprinted polymer as a sensing material for cytochrome c,在CdTe量子点表面包裹分子印迹聚合物特异性识别模板分子细胞色素c，印迹过程采用溶胶-凝胶法反应，印迹过程中提高了对模板蛋白的亲和性。与非印迹相比，量子点包裹的印迹材料使模板蛋白
22、的荧光强烈猝灭。CdTe量子点具有宽的发射波长，窄的半峰宽而且还可以与感兴趣生物分子反应生成化合物，使其在生物科学方面有非常大的应用前景。实验中巯基丙酸作为稳定剂制备的CdTe量子点不仅用来作为荧光标记，而且也作为特殊的功能单体，因为量子点表面可以通过不同作用接枝生物分子。更重要的是印迹空穴与模板分子的特异性相互作用还可以通过荧光标记识别。其制备过程包括：,1、水溶性CdTe量子点的合成 实验中于三颈圆底烧瓶中加入0.25mmolCdCl22.5H2O,53l巯基丙酸，180ml二次蒸馏水，用0.5M氢氧化钠调pH到10，氮气保护回流搅拌30min。然后加入用0.363gNaBH4 和0.06
23、36g Te新鲜制备的NaHTe水溶液1.5ml。在制备NaHTe水溶液时随着溶液的沸腾其颜色也将发生变化，等其完全变成无色时加入到三颈圆底烧瓶中。此时烧瓶中溶液变成了橙色。其荧光反射波长在540nm处。,2、荧光蛋白印迹粒子的合成 于25ml的圆底烧瓶中加入模板蛋白10mg，量子点10ml，20lAPTES搅拌30min.然后加入0.10mlTEOS，接着加入氨水(w/v)25%)0.10ml，搅拌12h.加入0.5%Tri离心清洗几次脱除模板蛋白。最终量子点表面包裹的分子印迹聚合物在使用时重新溶解在磷酸缓冲溶液中(PBS,pH 7.0)Tri(0.5%)。,3、分子印迹包裹的量子点表征 分别用荧光、紫外可见，红外、透射电镜、XRD对分子印迹聚合物进行了表征,谢谢,
