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1、,(Source:Lyer,V,The transcriptional program in the response ofhuman fibroblasts to serum.Science 283(1 Jan 1999)f.1,p.83),第7 章基因突变与交换Source:StanleyN.Cohen/Photo Researchers,IncGene Mutation&,Crossing-Over,7.1.Point mutation 的类型与机理,7.3.保证遗传稳定的机制,7.4.基因重组交换的分子机制,7.2.诱发突变,7.1.1.Point mutation 的类型,dNt d
2、eletion or insertion,=3x dNt=3x dNt,n xAmino acidFramshift,conversion(取代),Pu,Pu,transition(转换)transvertion(颠换),PyPy,PyPu,南京大学田大成等发现的遗传突变新机制,Nature，doi:10.1038/nature07175，Dacheng Tian，Jian-Qun Chen,第一，基因组各区域的突变率很不相同，自发突变的数量是由Indel的数量和密度所决定,第二，生物多样性最初变异来源主要是由Indel诱导产生第三，自然选择在很大程度上是通过对Indel的选择而实现,第四，生
3、物通过调节自身变异能力而适应环境的能力，突变在进化中的作用比人们原先想象的要大得多相当巨。,conversioneffect,-Samesense mut.-Missense mut.-Nonsense mut.,GAA(E)GAG(E)GAA(E)AAA(K)GAA(E)TAA(stop),突变的表达类型-获得突变型是遗传学研究的重要前提-非条件型突变；allelein DNA level(RFLP,RAPD)allelein phenotype(红花/白花，糯/非糯)条件型突变；突变的表现=突变基因型+诱导条件（光，温敏感不育，Ts,su-）,突变的表达类型,无效突变 Null mutat
4、ion：,完全消除了基因功能的突变（缺失）,功能丧失型突变（loss-of-function mutation）,无效突变或其他阻止基因功能的突变,功能获得型突变（gain-of-function mutation）,突变使蛋白质获得新的功能,沉默突变（silent mutation）,没有明显表型效应改变的突变,7.1.2.突 变 发 生 的 机 理,(自发突变，诱发突变),7.1.2.1.自发突变7.1.2.1.1.碱基异构式引起DNA复制过程的错误a)碱基异构式,A(amino)G(keto),A(imino)G(enol),C(a)G(k),C(i)G(e,i),T(keto),T(e
5、nol-2)orT(enol-4),b)碱基异构式引起DNA复制的错配,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第321页),碱基异构式引起DNA复制的错配,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第321页),碱基异构式引起DNA复制的错配,A(i,anti),A(a,syn),A(i,anti),G(k,syn),G(e,i,anti),G(k,syn)G(e,i,anti),A(a,syn),正确配对 A(a)错误配对 A(a)A(i),T(k)C(i)C(a),G(k)G(k)G(e),C(a)T(e)T(k),A(a)T(k)A(a,anti)T(k,anti),碱基异构式引起DNA
6、的错配突变A(a),C(i),C(i)A(a,anti)G(k,syn),syn),G(k)C(a)C(a,anti)G(k,anti),w.t.mut.,维持遗传的稳定性随机引起其他各类基因的突变,7.1.2.2.增变基因（mutatorgene）but be wronged,增变基因类别；,DNApolymerase 相关基因3 5editing function mutation错配修复系统的基因MCE(mismatch correctionenzyme)DNA损伤修复系统基因错配修复功能丧失 突变率升高,修复过程是基因突变的重要来源,7.1.2.3 不对称交换,内源转座子,(Retro
7、-transposon,Helitron),Indel,(Source:Lyer,V,The transcriptional program in the response ofhuman fibroblasts to serum.Science 283(1 Jan 1999)f.1,p.83),Crossing-Over,第7 章基因突变与交换7.2.诱发突变Source:StanleyN.Cohen/Photo Researchers,IncGene Mutation&,7.2.1.物理诱变,a)电离辐射诱变；Co60()()rayCs137()()rayH3()ray,()()ray穿透
8、性（外照射处理）()()ray非穿透性（内标记处理）,P32,S35()ray卫星搭载诱变；高真空，强辐射，微重力dNt电荷及结构改变,卫星搭载育种,太空蔬菜,微重力高辐射强射线(来源：不详),U.V.,C T T A,b)非电离辐射Ultra Violet light(U.V)-pyrimidine dimer(TT dimer)is generated bycovalent links between adjacent TT共价键,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第309页),U.V.deaminationoxidation,C,U,A(a),U.V.,H2O,H+OH-,C(i)
9、,A(a),C(a)U.V.depurination(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第309页),遗传多型性的概念（genetic polymorphism/hetergeneity）Allele(结构基因，DNA区域)Multiple allelesAllele in DNA,inversioninsertion,Point mutationdeletionRepetitive copies,Testing allele in DNA,electrophoresis pattern,1980Botstein 限制性片段长度的多型性,RFLP（RestrictinFragment Le
10、ngth Polymorphism）,VNTR(various number of tandem repeats),1985 K.B.Mullis 基于聚合酶链式反应的多型性,PCR-based polymorphism,1996 E.Lander单核苷酸多型性,SNP(single nucleotide polymorphism),7.2.2.,生物技术定点诱变,(来源：不详),基因的定点诱变,oligo-dNt 介导的定点诱变,合成与目标基因某区段互补并含突变位点的oligo-dNt,错配位点不能在3-end,renaturation,replication two times,(来源：分
11、子生物学（2007），郑用琏，第314页),设计两突变引物（mut.P1&mut.P2）两通用引物（commonP1&commonP2）第一次两种PCR产物混合，变性，复性其中一对双链分子不能进行第二次PCR另一对双链分子的PCR产物为诱变基因,引物重叠延伸的PCR诱变,cP1,mP1mP2,cP2,Mutants.,DNAshuffling 技术的基因诱变Digestion,ligation,transformation,selection,转座子介导的突变体库的构建定向选择表型鉴定AIMS,Ti质粒介导的突变体库的构建定向选择表型鉴定 gfp,插入突变体库的构建具有标签的植物突变体,T-D
12、NA-mediated Gene trap,LB,Gene trap,RB,是经过改造的质粒、转座子载体插入到基因组中使被插入位点正常基因功能丧失，通过载体携带的报告基因的表达及载体的保守序列识别插入位点并分离基因。根据结构和表现“陷阱效应”的插入位点：增强子陷阱（enhancertrap）启动子陷阱(promoter trap)基因陷阱（genetrap）,Ti质粒介导的基因突变,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第318页),GUS assay in rice flower organs(I),(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第319页),GUS assay in rice
13、flower organs(II),(来源：不详),Mutant Information:,BZ2 Mu Activator,Bz2,(来源：不详),Ac/Ds,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第81页),大型Mu插入突变体库,(来源：不详),QPM,(来源：不详),7.2.3.化学诱变a)干扰碱基合成的化学诱变剂,6-MercaltopurineSH干扰嘌呤合成,5-Amino UracilOH2NO干扰嘧啶合成,b)base anologs leads base mispairing,(5-BrU),BrBr(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第309页),BrU(k)Repl
14、ication,BrU(e),GC,ATreplicationerror,A/T5-BrU(k),G/C5-BrU(e),incorporationerror,G/C,A/T,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第311页),A(a)T(k),5-BrU(e),T(k),A(a),5-BrU(k),G(k)C(e),5-BrU(e)mispairing,A(a)5-BrU(k),G(k)C(a),G(k),A(a),Replication error,Incorporation error,G(k)5-BrU(k)mispairing,5-BrU(e),CG,InosineUracilXa
15、nthine,CAC,HNO2deamination,c)Base modifyingchemical mutagenHNO2(Nitrous acid NA)A,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第312页),Base modifyingchemicalmutagenNH2OH(Hydroxylamine HA羟胺),HNH,H,O,C(a),HA,HNH,H,H,O,H,N,H,HO,A(a),N,H,O,H,N,H,HOC(i),N H,HH,EMS(Ethyl methane sulfonate),CH3SO-CH2CH3,d)Alkylation agent mutagensO
16、,MMS,OO,CH3SO-CH3O,SM(Sulfur Mustards gas 硫芥子气),HS,CH2CH2ClCH2CH2Cl,-TA X AAAAGC,e)Mutageninsertion-framshift,扁平分子,AO(Acridine Orange)EB(Ethidium Bromide),-TAAAAAGC-,-A-T,TAO TTTTCG-AAAGC-,分子插入-ATTTTTCG-AO,EB,-ATTTCG-TAAAGC-,-ATXTTTTCG-TAXAAAAGC-,-AT EB TTTTCG-,Targeting Induced Local Lesions In Gen
17、ome,TILLING,靶向诱导基因组局部突变,突变型鉴定为主的正向遗传学研究,定向筛选突变基因为主的反响遗传学研究,基本技术：,引物分别被两种700nm/800nm荧光标记，PCR扩增PCR产物变性，复性，mut单链与w.t单链形成异源双链,根据基因组信息合成的特异引物CEL1错配碱基内切酶切割异源双链,化学诱变获得大量的突变体双色变性PAGE检测电泳,7.3.保证遗传稳定的机制,(来源：不详),复制过程中的错配修复基因的回复突变致死突变,DNA的损伤修复密码的简并多倍体,7.3.1.复制过程中的错配修复机制(=10-11),+-A-,-C-DNAmismatch,DNApol(=10-8)
18、经第二次校正=10-11,MRSMismatch,RepairSystem,7.3.1.1.Mismatch repair systemDNApolymeraseligase,dam gene,m6A甲基化酶,MCE(mismatch correctenzyme)3 subunits mutH,L,S识别新生链中非m6A 的GATC序列Scanning 新生链中错配碱基酶切含错配碱基的新生DNA区段,3-C-CTAG-CTAG-5,5,DNA中的GATC(palindromicseq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.MCE scanning-T-GATC-GATC-
19、3,3-5,少,梯度,多（m6A）新生链,MCE scanningendonucleasePolymeraseligase,GATC,GATC,CTAGGATCCTAGGATCCTAG,CTAGCTGATCCTAGTGATCCTAGAT,7.3.1.2.ung system(尿嘧啶-N-糖苷酶系统),-TAGC-,-ATCG-,-TAGC-,-AUCG-,-TAGC-,ung-ase,AUCG,-TAGC-A CG-,UApurinase(内切酶),DNApolligase,-TAGC-ATCG-,-TT-AA-,7.3.2.DNA的损伤修复7.3.2.1.photo reactivation
20、 Beforereplication&Error-free 400 nm Blue light&phR gene,(photo-reactivationenzyme)-TT-AA-,-TT-AA-可见光激活-TT-AA-phR 471aa,7.3.2.2.ExisionRepair,BeforeReplication Error-freeUvrA,B,C geneEndonucleasesExonuclease,切补修复,DNApol Ligase(来源：不详),E.coli存活%,U.V 计量,w.t.UvrA+RecA+,RecA+uvr a-,rec a-uvr a-,Rec-A.gen
21、e 以某种方式参与DNA损伤修复,7.3.2.3.RecombinativeRepair,TTAA,TTAA,TTTTAA,TTTTAA,TT,TT,变性,Rupp.Howard-FlandersU.V.复制D.S.DNA,提取,变性S.S.DNA,TTAA,TTAA,TTAA,继续复制,E.colik12,w.t.uvr-a/Rec-AUvr-A/rec-auvr-a/rec-a,500830.2,320050201.3,Genotype,(尔格/mm2)TT数量/107bp,存活率为对照37%的U.V.计量 存在与重组有关的暗修复机制 与Rec-A基因引起的strandtransfer有关
22、 TTdimer未被修复，仅表现在后代群体中TTdimer浓度的稀释 链的非准确转移，导致突变机率的增加,RecombinativeRepair(strand transfer repair),AfterreplicationrepairError-prone,RecA,DNA polymeraeligasegenes be needed,(来源：不详),7.3.2.4.SOS repair,(U.V.reactivation or W reactivation)JeanWeigle,E.coli,80,10,100,mut.100%,50%,10%,Damaged DNA of phage
23、be repaired in E.coliA SOS repairin E.coli have to be induced by U.V.(A&B)High frequency mutation by SOS repair(Error-prone),A,BE.coli,CE.coli,DNAdamaged,signal300 X,RecA cleaves LexA,SOS,UmuC mutation,-Before inducing.LexA-p,Rec-A,UmuC11genes,Neg.repression,-U.V.,damage DNA,机制,Signal(S.S.DNAtail or
24、 5Nt S.S.DNA)(来源：不详),(Source:Bagg et al.P.N.A.S.78:5751,1981),witha UV of 10 J/m2.,measured the-,galactosidase activity,cells with the lacgenes undercontrol of the,umuDC promoter,umuDC promoter is UV-inducible,with a UV,Genetic regulation network,CRO-like,(来源：不详),Dynamics,PART 2,PART 1,LexAPART 3(来源
25、：不详),PART 2,PART 1,LexAPART 3(来源：不详),PART 2,PART 1,LexAPART 3(来源：不详),RecA-P;三种功能,DNA重组活性,与S.S.DNA结合活性,少数蛋白的proteinase活性,当DNA正常复制时,（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）,RecA-p不表现proteinase活性,当DNA复制受阻/DNA damaged,细胞内原少量表达的RecA-p,与S.S,DNA结合,激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解,RecA-p高效表达300 times up,SOS open能量大量消耗,当DNA
26、复制度过难关后,SOSrepair 是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）,RecA-p很快消失,LexAgene on,SOS off,未经修复,经过修复/校正,死亡突变率降低,倾向差错修复(间接）(重组修复，SOS）,避免差错修复（直接）(光修复，切补修复),形成突变,不形成突变,7.3.2.5.突变的形成DNA物理诱变，化学诱变，自发突变DNAdamaged/mispairing,突变是在修复过程中形成的（非准确的修复）,7.3.3.基因的回复突变（back mutation/reverse mutation）7
27、.3.3.1.回复突变的概念,wild type,mutant(in phenotype),mutation(low F.),back mutation(very low F.)7.3.3.2.回复突变的分子机制a)AGC(Ser)ACC(Thr)AGC(Ser)b)AGC(Ser)AGG(Arg)AGT(Ser)c)AGC(Ser)AGG(Arg)AAG(Lys),if Ser Lys,d)Intragenic suppression,(第二位点突变引起的基因内校正/密码子间两次错义突变的互补),e.g.trp.A,(lys)(Gly)-UGG174-GGA210-(w.t.),back m
28、utation,（Gly）,-UGG 174-GGA210-,-UGG174-GGA210-,-UGC174-GAA210-,(Cys)无活性结构,C,活为高,(Lys)(Glu)如何采用简单的遗传学方法区别无活性结构dNt的回复突变与intragenic mutation?!这种回复突变有时表现性结构 温敏感型?!,Intergenic suppression2（Su）,Nonsense,suppressor,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第329页),suppression2Missensesuppressor,GlyAGAUCUArgGly,GGACCUIntergenic,U
29、CUGly,UCUGly,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第330页),Intergenic suppresion-3(多聚体酶类构型的吻合),ASubunit-1,BSubunit-2,+,ActiveformInactiveform,Backmut,a,Bb,Activeform(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第332页),(Source:Lyer,V,The transcriptional program in the response ofhuman fibroblasts to serum.Science 283(1 Jan 1999)f.1,p.83),第7 章基因
30、突变与交换Source:StanleyN.Cohen/Photo Researchers,IncGene Mutation&,Crossing-Over,7.4.1.自然界的DNA分子均是重组体,(recombinant),变异是生物进化的重要因素之一,生物对环境的适应机制自然选择的重要基础,可遗传的变异；突变（点突变，染色体变异）频率低，突变修复突变压改变群体的基因频率Pn=(1-P0)n,遗传重组交换染色体的自由组合染色单体间的交换分子克隆和转基因技术(invitro),普遍发生自然界DNA分子均是重组体,7.4.2.遗传重组的类型,a)Homologous Recombination,o
31、ccurbetween Homo-chromosome/Homo-seq.,sister&non-sister chromatidstransformation,transduction,conjugation,transfection largefragment exchange,Recombination site is in hotspot mostly Recombinase be needed(RecA,BC),(Source:Molecular Biology(2002),Robert F.Weaver,Page719）,7.4.3.Homologous recombination
32、7.4.3.1.前期的两种假说a)Breakagerejoining(1930 Darlington),aA,bB,aA,Bb,b)copy-choice(1931 Belling),染色体的交换与复制有关！,c)Breakage rejoining model 的证据-1E.coli growing in a medium of C12&N14infected with phage ofABC&abc,ABC,abc,ABC,abc,AB,c,ab,C,RareRecom.,a,b,c,a,b,c,A,B,C,most,C13 N15,C12N14,C12N14E.coli,DNA分子的交换
33、是断裂错接的过程(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第334页),Breakage rejoining model 的证据-2E.coli growing in a medium of C12&N14infected with phage ofAB&ab,AB,C13N15,ab,C13N15,AB,ab,Ab,aB,rareDNA分子的交换与复制是两个不同的过程,a,B,A,b,rare,A,B,a,b,A,b,a,B,most,C12N14E.coli,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第334页),aA,a,A,A A,A,a,A,a,A,a,AAAaaa,a aA aa aa
34、 aa aa a,AAaaaa,aaAAAA,aaAAaa,AAaaAA,aaaaAA,AAAAaa,4/4,A:a5/3 3/5 2/6,7.4.3.2.同源重组的分子模式a)Illegitimate segregation现象 基因转换(geneconversion)Neuraspora一 A 条x 染a 色体上特定的遗传基因被同源染色体上的,等位基因所替代的非相互重组的现象基因转换A A A A a A a A,meiosis,aaA,A,aAa,A,Drosophila(ry 黄嘌呤脱氢酶),ry41-ry5()X ryxryx()a few w.t.ryx-ryx()X ry41ry
35、5()no w.t.,非全同等位基因内不同位点的影响？回复突变？基因间互补？转换不会伴随ry基因两侧基因的交换！雄果蝇染色体不发生交换！基因内交换！,b)同源重组的基本特征 涉及同源染色体的同源序列间的联会配对 涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程 单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号c)同源重组的分子模式,1964Holliday.R1965.Whitehouse,HollidayIntermediatePolaron Hybrid DNAmodel,交换发生的相关事件,Synapsis;pairedDNAduplexes,RecBCD;nicks madei
36、n homologousstrands,betweentwo DNA,RecA;leads to brokenendsmove andcross-over,to pair with complementin other duplex,Holliday Intermediate structure,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第336页),Pp,Qq,Rr,Q;A/T q:C/G,Pp,Qq,Rr,Q;A/T q:C/G,Nicksare sealedCross-overpoint movesby branch migrationIsomerizationGenerateplanar
37、molecularby rotation(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第336页),R,r,未交换Q,q含C/T 结构R,r发生交换Q,q含C/T 结构,Resolutionin twodirectionsHeteroduplexregion madein Q/q(C/T),(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第336页),C/T,A/T,PtRt,PR+prPr+pR,11,Qq,53,Heteroduplex region replication correctand illegitimate segregation,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第338页),第二
38、条染色单体内C/T的校正可能,第一条染色单体,内C/T校正可能,C/T A/T C/T C/G,未校正,C/T A/TC/T C/G未校正,AAAAAACC AACCAACC AAACAACCTTTTTTGG TTGGTTGG TTTGTTGG(6:2)(4:4)(5:3)AACCCCCC AAACCCCCTTGGGGGG TTTGGGGG(2:6)(3:5)AAACACCCTTTGTGGG(4:4),杂合DNA区域内C/T的校正与否与形成不同比例的异常分离配子,conclusion,交换不是简单发生在1bp之间的断裂错接事件 交换涉及两条D.S.DNA之间的hollidayintermedi
39、ate,branch migration,isomerization,resolution 等一系列复杂的过程 交换发生后，其两端的会出现Pt:Rt=1:1的正常分离比例 当交换发生在某对等位基因内，其突变位点可能因交叉移动，而被包括在heteroduplexregion之内，从而引起基因转换 基因转换(conversion)发生的机率,随突变位点离DNA crossoverpoint的距离增大，而表现逐渐变小的极性梯度的效应,palaronhybrid DNA model,Nsph I Acc-I R-V Bel-I Dra-III,Aha-II,Bgl-II,9.6%7.4,6.2,3.4
40、,2.8,1.5,0.4,5,3,e.g.yeastArg4 gene（1989年，JackSzostak）7 multipalleles(非全同 等位基因)Nsph I,Acc-I,R-V,Bel-I,Dra-III,Aha-II,Bgl-II在杂合二倍体中，基因转换频率从5 3极性递减Why?,d)相关酶类及交换热点,RecA-p;,RecA-p binding with S.S.DNA ATPase activity,(S.S.DNAdependentATPase activity),40kd monomer 2000/cell U.V.bleomycin,mitomycin,RecA-
41、p to 5000/cell,(来源：分子生物学（2007），郑用琏，第339页),Rec A in Prok.,ssDNA,binding withRecA,(来源：不详),Rec.A-p,Hydrogen bond reform,heterodulpex,Rec A in Euk.,RecB.C,DP,Rec-b,c,d mut.,同源重组率下降100X,RecBCD complex 300kd 具有解链酶活性（ATPase）&核酸外切酶活性重组蛋白BCD具有产生单链尾的功能。产生的单链尾被重组蛋白A（RecA protein）（recA基因产物）包裹，同时重组蛋白BCD帮助将RecA蛋白
42、装载到3-DNA尾上。,使D.S.DNA,nick,releaseS.S.DNA(被RecA-p结合),使crossoverpoint 沿D.S.DNA解旋的方向移端(migration)使heteroduplexregion 重新形成螺旋 RecBCD-p特异识别GCTGGTGGT序列并在其下游4-6bp处切断S.S.DNA(chi)sequence Chiasma 交换热点Homologous RecombinationRecBCD pathway,RecBCDpathway,(Source:Molecular Biology(2002),Robert F.Weaver,Page720）,
43、RecBCD,4-6bpOHRecA-p,chiDNA解旋,再螺旋,(chi)seq具有物种和基因的特异性,Chi-specific nicking of,80Nt游离单链,80Nt,DNA by RecBCD.(Source:Ponticelli,A.S.,Chi-dependentDNA strand cleavage by recBC enzyme.Cell 41(May 1985)f.2,p.146.),Nsph I Acc-I R-V Bel-I Dra-III,Aha-II,Bgl-II,9.6%7.4,6.2,3.4,2.8,1.5,0.4,5,3,Jack Szostak所证明
44、的YeastArg4 位点的基因转换现象,始于靠近基因的5-端双链DNA的断裂(DSBDouble-StrandBreak)所引发的重组,引发DSB的因子？,(Source:Molecular Biology(2002),Robert F.Weaver,Page732）,Spo11 分 子 利 用tyr135攻击DNA的两条单链，tyr与被切割的DNA5磷酸发生共价连接。不对称的切割产生两种不同大小的与Spo11连接的寡核苷酸,(Source:Molecular Biology(2002),Robert F.Weaver,Page735）,重 组 酶(Rad51 和Dmc1利用Spo11释放的DSB缺口不对称地的负载到新,产生的单链区域，（蓝色）蛋白包裹一条链，（橘色）蛋白包裹另一条链。入侵一个同源双螺旋，起始Holliday 中间体的形成,(Source:Molecular Biology(2002),Robert F.Weaver,Page737),将一切生物学问题还原到DNA水平的同时,人类必将用整体的，,综合的观点去思考生物学,in your final test,Good luck,(来源：不详),Thanks for marker,your cooperationand understanding,(来源：不详),
