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1、第十五章 厌氧菌,第一节 概 述,厌氧性细菌(anaerobic bacteria)指一群在有氧条件下不能生长，必须在无氧条件下才能生长繁殖的细菌。,厌氧菌的分类,分为两类：一类为有芽胞厌氧菌，只有一个属，即梭菌属，共有130个种，以芽胞形式存于体外。另一类为无芽胞厌氧菌，包括40多个属，300 多个菌种和亚种；多为体内正常菌 群，存在于皮肤、口腔、上呼吸道、肠道和泌尿生殖道。易引起这些部位的内源性感染。,厌氧菌感染的条件,局部组织的氧化还原电势降低：如血管损伤、烧伤、动脉硬化、肿瘤压迫、组织坏死等，可造成局部组织的缺血、缺氧等。皮肤黏膜屏障被破坏：如大面积外伤伴有需氧菌感染，为厌氧菌感染提供
2、了条件。机体免疫功能下降：如接受免疫抑制剂、放疗或化疗的患者；糖尿病、慢性肝、肾疾病及老人、婴幼儿、早产儿等。菌群失调：长期或大量应用广谱抗菌药物无效的患者，均可诱发厌氧菌感染。,厌氧菌感染的临床特征,局部有气体产生为重要指征之一发生在黏膜附近的感染深部外伤如枪伤、人或动物咬伤后的继发感染分泌物有恶臭或暗红血色或在紫外光下发出红色荧光，或脓汁中有硫磺颗粒即为放线菌感染某些抗生素治疗无效的感染革兰染色着色不均、形态奇特、呈明显多形性；或镜检见细菌而需氧培养为阴性者。,第二节 厌氧菌的检验,标本的采集与运送是否适当，对厌氧菌培养能否成功至关重要。临床在进行厌氧菌培养前应与实验室联系，以便实验室做好
3、接种培养的准备。须注意两点：标本不能被正常菌群所污染；应尽量避免接触空气。某些标本不适合做厌氧菌培养：如鼻咽拭子、痰液、流出的脓液、阴道分泌物、粪便等。,标本的检查方法,实验室收到标本应在2030min内处理完毕，最迟不超过2h。如不能及时接种，应将标本保存于室温（冷藏对厌氧菌有害）。直接检查：实验室收到标本应仔细观察其性状，包括气味、是否脓性、带血或黑色坏死组织、硫磺样颗粒及紫外灯下有无荧光等。除血液外，各种标本均须直接涂片作革兰染色镜检，发现染色不均，形态奇特者常为厌氧菌的表现。,菌 名 革兰染色 形态及其他特征,脆弱类杆菌 G 两端钝圆着色深，中间色浅不均匀，有空泡，长短不一，标本有琥珀
4、味产黑色素普雷沃菌G 球杆菌，可见多形性，长短不一，紫外线照射发红色荧光，标本有恶臭具核酸杆菌G 菌体细长，两头尖，紫色颗粒沿菌体长轴成双排列，标本有丁酸味坏死梭杆菌G菌体细长，高度多形性，长短不一，菌体中部膨胀呈圆球形韦荣球菌G极小的革兰阴性球菌消化链球菌G球形或卵圆形，呈链状的小球菌，易染成阴性乳酸杆菌G 细长无芽胞，有时多形性，标本有乳酸气味痤疮丙酸杆菌G排列呈X、Y、V或栅状，标本有丙酸气味放线菌G分枝呈棒状，X、Y、V或栅状排列，脓汁中的黄色颗粒呈琥珀酸气味破伤风梭菌G细长鼓槌状，极端芽胞，圆形产气荚膜梭菌G粗大杆菌，呈单或双排列，有芽胞，有荚膜艰难梭菌G粗长杆菌，芽胞卵圆形或长方形
5、，位于次极端,厌氧菌的初步鉴定,标本的分离培养,初代培养：厌氧菌的初代培养比较困难，不仅要创造无氧环境，还要选择适当的培养基。在培养基选择上应注意：1.尽量使用新鲜培养基，24内用完；2.使用前放入无氧环境，预还原处理2448；3.也可采用预还原灭菌法制备的培养基；4.液体培养基应煮沸10min，驱除溶解氧，并迅 速冷却，立即接种。,培养基的选择,根据镜检结果选择合适的培养基，常用的有非选择性和选择性培养基两种。非选择培养基：以牛心脑浸液及布氏肉汤为基础，补充0.5%酵母浸出液，5g/ml氯化血红素、10 g/ml维生素K1及5%10%的脱纤维血的强化血平板。几乎能培养出所有的厌氧菌。,培养基
6、的选择,常用的选择培养基:1.七叶苷胆汁平板（BBE）用于脆脆弱类杆菌 2.卡那万古冻溶血平板（KVLB）可抑制大多数兼性 厌氧菌，使产黑色素普雷沃菌早期产生黑色素 3.FS培养基 梭杆菌选择培养基 4.VS培养基 韦荣球菌选择培养基 5.CCFA培养基 艰难梭菌选择培养基 6.卵黄平板（EYA）和兔血平板 产气荚膜梭菌,标本的接种,初代培养应同时接种固体、液体两种培养基，且每份标本应同时接种3个平板，分别置有氧、无氧和含510%CO2环境培养。为了便于在混合培养物中发现厌氧菌，一般将标本分3区划线接种于平板上，在1、2区交界处，贴一张含5g/片的甲硝唑纸片，如纸片周围出现抑菌圈，表明有厌氧菌
7、存在。,培养方法,通过物理、化学或生物学等方法，创造一种无氧的环境常用的厌氧培养法：1.厌氧罐法 2.气袋法 3.厌氧手套箱 4.厌氧工作站,结果观察,厌氧菌的初代培养生长较慢，故应在48后才能初步观察观察时应注意：1.厌氧菌在对数生长期对氧非常敏感，故在 培养的48内不应使细菌暴露于空气中 2.标本镜检阳性，但培养48却无菌生长，应继续培养57。,次代培养和厌氧菌的确定,初代厌氧培养有细菌生长时，必须做耐氧试验以确定是否为厌氧菌。方法：从每个平板上挑取45个不同性状的菌落，每个菌落分别接种3个平板（每个平板分46个区，可同时做46个菌落的次代培养）。分别放有氧、无氧和含5%10%CO2环境中
8、培养48，如只在厌氧环境中生长的细菌，即为厌氧菌。,鉴定试验,形态与染色：不仅能反映各种厌氧菌的特殊形态，同时也为鉴定厌氧菌提供参考依据。菌落性状：包括其形态、大小、色素、荧光及溶血等快速鉴定：其原理是依据细菌在代谢过程中所产生的胞外酶与少量生化基质迅速反应，能在4小时观察结果，无需在厌氧环境下培养，只需用浓菌液即可。其他：气液相色谱、PCR和基因探针等方法。,第三节 厌氧球菌,厌氧性球菌(Anaerobic cocci)是临床厌氧感染的重要病原菌，约占临床厌氧菌分离株的25主要包括革兰阳性:消化球菌属 消化链球菌属革兰阴性:韦荣球菌属,消化球菌属,黑色消化球菌(Peptococcus nig
9、er)是消化球菌属中唯一的菌种。革兰阳性球菌。直径0.31.3m，单个、成双、短链或成堆排列。无芽胞，无荚膜。专性厌氧菌，生长缓慢，厌氧培养24天形成黑色不溶血的小菌落。标本黑色有臭味是该细菌感染的重要特点。,消化链球菌属,代表菌为厌氧消化链球菌（P.anaerobius）革兰阳性球形或卵圆形，大小不等，菌体直径0.31m，常成双或呈短链状排列。无鞭毛，无芽胞，无荚膜。,消化链球菌培养特性,专性厌氧，营养要求较高，需羊血和血清培养基才能生长。在厌氧血平板上，菌落直径0.51mm、灰白色、凸起、不透明、边缘整齐，一般不溶血，偶有甲型或乙型溶血。生化反应不活泼，在硫乙醇酸钠液体培养基中，呈颗粒状沉
10、淀生长。在其平板上生化反应较为明显，吐温-80可促进其生长。,韦荣球菌属,韦荣球菌属细菌形态相似，为革兰阴性球菌。直径0.30.5m，多排列成对、近似奈瑟球菌。无鞭毛、无芽胞。专性厌氧，血琼脂平板上生长良好，培养48h 后，形成直径12mm圆形、凸起、灰白色或黄色混浊、不溶血菌落；在硫乙醇酸盐肉汤中混浊生长，产生小气泡。新鲜培养物立即置紫外线下照射，菌落可显红色荧光，接触空气后荧光消失。生化反应不活泼，不分解糖类，还原硝酸盐。,第四节 革兰阴性无芽胞厌氧杆菌,这是一群不形成芽胞的厌氧杆菌，是人体正常菌群的重要组成成员，部分菌株可作为条件致病菌引起感染。常见菌属有：类杆菌属 普雷沃菌属 紫单胞菌
11、属 梭杆菌属,类杆菌属,类杆菌属(Bacteroides)是临床上最重要的革兰阴性无芽胞厌氧杆菌，临床标本中以脆弱类杆菌（B.fragilis）最常见。脆弱类杆菌为革兰阴性，大小为(0.81.3m)(1.68m)，着色不均，两端钝圆而浓染，中间不着色染色较浅似空泡。在陈旧培养物或含糖的液体培养基中呈明显多形性，无鞭毛、无芽胞，多数有荚膜。,普雷沃菌属,普雷沃菌属(Prevotella)是从类杆菌属分出的一个新菌属，代表菌种是产黑色素普雷沃菌(P.melaninogenica)。革兰阴性球杆状，大小约0.81.5m1.03.5m，排列成双或短链，两端钝圆，有浓染和空泡。,产黑色素普雷沃菌培养特性
12、,专性厌氧菌，在厌氧平板上23天培养后，菌落直径为0.53mm，圆形、凸起、不透明，许多菌株呈-溶血。菌落在紫外光（波长366nm）照射下有砖红色荧光，逐渐转为褐黑色和棕色菌落，57天转为黑色菌落，色素出现后荧光即消失。,紫单胞菌属,紫单胞菌属(Porphyromonas)又称卟啉单胞菌属。代表菌种是不解糖紫单胞菌。革兰阴性杆菌或球杆菌，大小约1.53.5m0.81.5m，两端钝圆，着色不均匀。3537厌氧培养35d可形成12mm圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、棕色或黑色菌落。维生素K1和氯化血红素可促进本菌生长及黑色素的产生。,梭杆菌属,梭杆菌属（Fusobacterium）是临床常见的革兰
13、阴性无芽胞厌氧杆菌，形态细长，两端尖细如梭。,坏死梭杆菌形态,致病性,坏死梭杆菌是毒力很强的梭杆菌，常引起急性扁桃体炎，有时并发单核细胞增多症，是儿童和青年人扁桃体周围脓肿中最常分离到的厌氧菌。局部症状还包括颈间隙感染和颈静脉脓毒性血栓静脉炎，尚可引起胸膜渗出性脓胸、增生性转移脓肿和菌血症。,第五节 革兰阳性无芽胞厌氧杆菌,革兰阳性无芽胞厌氧杆菌(anaerobic nonsporeforming Gram-positive bacilli)有6个属，几十个菌种，临床常见的有丙酸杆菌、优杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、蛛网菌和放线菌。它们多是人和动物皮肤、口腔、肠道等部位的重要生理菌群，在体内起到调
14、节和维持人体微生态平衡的重要作用。它们的菌落、生化反应、菌体形态等都很相似，鉴定较难。应用气液相色谱法（GLC），根据其代谢产物不同，可对菌属做出初步判定。,第六节 梭状芽胞杆菌,梭状芽胞杆菌属（Clostridium）简称梭菌属，是厌氧芽胞杆菌（anaerobic sporeforming bacilli）的唯一菌属，有130个种。革兰染色阳性，芽胞呈圆形或卵圆形，直径大于菌体，位于菌体中央，极端或次极端，使菌体膨大呈梭状。本菌属细菌在自然界分布广泛，临床有致病性的主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌与艰难梭菌等。,破伤风梭菌（C.tetani）,破伤风梭菌是梭菌属中常见的一种芽胞杆菌，
15、能引起破伤风得名。菌体细长，约为2.05.00.51.5m。有周鞭毛，能运动，无荚膜。芽胞正圆形大于菌体，位于菌体顶端呈鼓槌状。,鞭毛,破伤风杆菌镜下形态（18 24h）革兰染色,破伤风杆菌镜下形态（48h）革兰染色,培养特性,专性厌氧，在梭菌培养基（cd基）上37培养48h，菌落直径24mm，扁平、灰白色、边缘疏松呈羽毛状，伴溶血。在庖肉培养基中，肉渣部分消化，微变黑，有少量气体。生成甲基硫醇及H2S，导致培养物有腐败性恶臭,破伤风杆菌在厌氧平板上羽毛状菌落 左侧：在疱肉培养基上生长 右侧：阴性对照,致病条件与毒素,伤口需形成厌氧微环境伤口窄而深（如刺伤），有泥土或异物污染大面积创伤、烧伤，
16、坏死组织多，局部组织缺血有需氧菌或兼性厌氧菌混合感染的伤口无侵袭力，仅在局部繁殖，外毒素致病对氧敏感的破伤风溶血毒素(tetanolysin)质粒编码的破伤风痉挛毒素(tetanospasmin)属神经毒(neurotoxin)，毒性极强(对人致死量1g)蛋白质，不耐热,作用机制与免疫性,作用机制见图破伤风免疫属外毒素免疫，主要是抗毒素发挥中和作用抗毒素人工免疫,典型症状苦笑面容角弓反张其他,微生物学检查法,一般不进行涂片镜检和分离培养典型的症状和病史即可作出诊断,防治原则,防止创口厌氧微环境的形成特异性预防：注射破伤风类毒素紧急预防：注射破伤风抗毒素（tetanus antitoxin，TA
17、T）特异性治疗：早期足量抗毒素及抗生素,产气荚膜梭菌(Cperfringens),两端平切粗大杆菌芽胞位于次极端，呈椭圆形，不大于菌体无鞭毛体内有明显的荚膜,培养特性生长迅速，代谢活跃，45生长最好血琼脂平板：双层溶血环 内环完全溶血-毒素 外环不完全溶血-毒素蛋黄琼脂平板：Nagler反应牛奶培养基：“汹涌发酵”（stormy fermentation）,双层溶血环,B,Nafler反应,汹涌发酵现象,C,致病物质,毒素以A型产生量最大引起血管通透性增加伴大量溶血、组织坏死、肝脏、心功能受损在气性坏疽的形成中起主要作用、毒素引起坏死损伤和血管通透性增加肠毒素,所致疾病,气性坏疽食物中毒,微生
18、物学检查法（一）,直接涂片镜检深部创口取材涂片革兰阳性大杆菌白细胞少且不典型伴有其他杂菌早期诊断可避免患者最终截肢或死亡,分离培养及动物实验接种血平板或庖肉培养基，镜检及生化反应鉴定动物实验如怀疑食物中毒，在发病后一日内，检出大于105病菌/克食品或106病菌/克粪便可确立诊断,微生物学检查法（二）,防治原则,预防及时处理伤口，破坏和消除厌氧微环境预防性的使用抗生素治疗局部感染的处理抗生素抗毒素高压氧舱法,肉毒梭菌（Cbotulinum）,芽胞椭圆形，粗于菌体，位于次极端，呈汤匙状或网球拍状神经毒素分AG 7个型，各型毒素只能被同型抗毒素中和肉毒毒素不耐热，煮沸1分钟即可被破坏,致病性,致病物
19、质 肉毒毒素剧毒（对人致死量为0.1g),作用机制,作用于外周神经肌肉接头处，抑制外周神经介质乙酰胆碱的释放，导致弛缓性麻痹前体分子存在，可稳定存在于外环境和胃肠道。复合物进入小肠后，在碱性情况下解离，被吸收进入血循环,所致疾病,食物中毒进食污染食物（多为罐头、肉制品、豆制品）发生食物中毒-食入毒素临床表现：少见胃肠道症状，主要为神经末梢麻痹（松弛型）婴儿肉毒病以6个月以内的小婴儿居多症状与肉毒食物中毒类似，便闭、吸乳、啼哭无力,微生物学检查法,标本食物中毒患者：食物婴儿肉毒病患者：粪便粪便、食物等标本可先80加热10分钟，再厌氧培养毒素检查,防治原则,加强食品卫生管理和监督，提高防范意识（低
20、温保存食物，高温破坏毒素）尽早根据症状作出诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素，同时加强护理和对症治疗,艰难梭菌（Cdifficile）,该菌是人和动物肠道寄生菌，在幼儿的粪便中最常见，为肠道正常菌群成员长期或大量使用抗菌药物后，使得艰难梭菌被药物选择出后大量繁殖而导致抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhea）。,生物学性状,革兰阳性粗长杆菌，大小约1.31.6m3.66.4m，有的菌株有周鞭毛，芽胞为卵圆形，位于菌体次极端，无荚膜。严格厌氧，在血琼脂平板上，48h培养后，菌落直径35mm，圆形，略凸起，白色或淡黄色、不透明、边缘不整齐、表面粗糙。在CCFA平板上生长的菌落在紫外线照射下可见黄绿色荧光。,艰难梭菌在血平板上菌落特征48h,艰难梭菌在CCFA平板上菌落特征48h,致病性,产生A、B两种毒素A毒素为肠毒素，能使肠壁出血坏死，液体积蓄 B毒素为细胞毒素，能直接损伤肠壁细胞，造成伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)。,
