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1、天 然 药 物 化 学,第三章 提取分离方法,开始提取分离前的准备:,了解分离对象(动、植物)的学名、产地、药用部位、采集时间和方法。了解被提取化学成份的结构类型。充分查阅工具书、文献，借鉴前人的工作。明确分离的任务-系统分离还是单体化合物的分离。,专业期刊：Natural Product Report(Nat.Prod.Rep.);J.Natural Product(J.Nat.Prod.);Phytochemistry;Planta Medica;Tetrahedron;Tetrahedron Lett.;Chemical CA(美国化学文摘).各国专利,一.中草药有效成分的提取,1.溶剂
2、法：,相似相溶原则,溶剂性质,环己烷 石油醚 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇,极 性,亲脂性,亲水性,溶解范围最广的有机溶剂：乙醇,与水分层的有机溶剂：环己烷 正丁醇,能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇,与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮 甲醇,极性最大的有机溶剂：甲醇,极性最小的有机溶剂：环己烷,介电常数最小的有机溶剂：石油醚,比水重的有机溶剂：氯仿,石油醚或汽油-低极性：,油脂、腊、叶绿素、挥发油、游离甾体及三萜类成分,氯仿或乙酸乙酯-中等极性:,游离生物碱、有机酸及黄酮、香豆素苷元等中性成分,丙酮或乙醇、甲醇-强极性:,苷类、生物碱盐以及鞣质等极性成分,提取氨
3、基酸、糖类、无机盐等水溶性成分,水-强极性:,提取方法,3.升华法,适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的成分的提取，如挥发油、小分子的香豆素类、小分子的醌类成分。,固体物质受热不经过熔融，直接变成蒸汽，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。中草药中有一些成分具有升华的性质，可以利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。,2.水蒸气蒸馏法,(二)根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,1.液-液萃取与分配系数K值,分配难易与分离因子 b,1.温 度：重结晶,2.混合溶剂：沉淀,酸碱性：酚，酸，生物碱(酸溶碱沉),4.可逆化学反应,b 100,1,100 b 10,
4、萃取次数,10 12,b 2,100,二.中草药有效成分的分离与精制,(一)根据物质溶解度差别进行分离,3.分配比与pH,样品水溶液,水相,有机相,水相,有机相,水相,有机相,水相,有机相,水相,有机相,水相,有机相,pH 3,pH 2,pH 9,pH 3,pH 13,pH 6,强极性，中性物质,碱性物质,酸性物质,中性物质,酸性物质,4.逆流分溶法(CCD),5.液-液萃取与纸层析,6.液-液分配柱色谱,7.液滴逆流色谱（DCCC）及高速逆流色谱,(三)根据物质的吸附性差别进行分离,1.物理吸附,吸附剂,溶质,溶剂,极性吸附剂：硅胶、氧化铝,待分离成分,水、有机溶媒,相似相溶,官能团的极性,
5、可根据溶剂的介电常数(e)判断极性大小,四.柱 层 析Column Chromatogrphy,常压柱层析(0.150g)（Ordinary Column Chromatogr.）吸附性柱色谱 分配性柱色谱 植物有效 柱色谱 离子交换柱色谱 成分分离 凝胶过滤柱色谱 主要手段 聚酰胺柱色谱 大孔吸附树脂,(一).吸附柱色谱法(硅胶、氧化铝）,1）样品量与吸附剂用量：,一般：1 30 60,细分离：1 100 200,2）柱径与柱长：,3）装柱和上样：,一般：115 20,A.湿法上样,B.干法上样,5）洗脱：梯度洗脱,4）吸附剂和洗脱条件的选择：,2 上样 1)湿法 溶剂溶解上样（少量），低极
6、性 2)干法 低极性溶剂溶解性差 3 洗脱 常压 低压 梯度洗脱 4 收集与检查 等份 TLC UV,（二）.聚酰胺（Polyamide）1 原理 a 氢键吸附原理 酰胺键 酚类、酸类、醌类、硝基化合物 成氢键能力与溶剂有关 水甲醇乙醇丙酮稀氨液稀NaOH 氢键吸附规律：基团多少；基团位置；芳香核，共轭双键；分子内氢键 b 极性吸附原理 非极性脂肪链 萜类、甾体、生物碱 黄酮苷与苷元 非水（正相）含水（反相）,2 聚酰胺粉的制备 国产（1530目）层析用（80100目）粗粉蒸馏水浸泡过夜，磨细，混悬液直接使用 抽滤后，6080度烘干23小时备用 3 操作 a 装柱 细粉水浸泡装柱，自然沉降 b
7、 上样 2030%水溶液上样 40-60:1 c 洗脱 水 含水醇 95%醇 3%NaOH 5%NaOH 4 再生 5%NaOH,(三).分配性柱层析 1 原理 利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达 到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分 离效果愈好。2 支持剂 硅胶、硅藻土、纤维粉 3 溶剂系统的选择 PC层析选择 4 操作 a 装柱 b 上样 c 洗脱,四、凝胶柱层析（Sephadex LH-20）1 葡聚糖凝胶简介 由葡聚糖凝胶Sephadex G-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附层析、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙
8、酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。德国科学家Hans Henke著有Sephadex LH-20凝胶色谱分离专著，详尽叙述了Sephadex LH-20在植物化学研究中的应用。,2 原理 分子筛：分子的大小和形状 吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键 分配层析：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定 相（凝胶）之间的分配 3 操作 a 装柱 洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱 b 上样 c 洗脱 水溶性好 水或电解质溶液 水溶性差 醇水或丙酮水 极性较小 丙酮、氯仿,d
9、浓缩 视情况而定 e 再生 洗脱剂平衡 有污染：0.2N NaOH-0.5N HCl 浸泡 水洗净-平衡 保存：50%丙酮水溶液 4 应用实例 例如，Sephadex LH-20层析分离川穹里的腺嘌呤，贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶，日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多种中草药中的芦丁芸香苷，红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。,（四）.大孔吸附树脂1 简介 大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺，是由苯乙烯、二乙烯
10、或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构。药液通过大孔树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的有效方法。非极性吸附树脂在吸附药液中成分时,主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用，不同的树脂有不同的针对性。其操作的基本程序大多是：提取液通过大孔树脂吸附上有效成分的树脂洗脱洗脱液回收洗脱液干燥半成品。该技术目前已较广应用于新药的开发和生产中,主要用在分离和提纯过程中。,2 大孔吸附树脂的优点 经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。大孔树脂吸附技术还
11、能缩短生产周期,所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。3 大孔吸附树脂吸附机理,4 操作 a 树脂预处理 b 装柱 c 上样 d 洗脱 e 树脂再生 5 实际应用 适合中等程度的水溶性化合物 中药、天然色素，从 发酵液中得到抗生素、（青霉素先锋霉素螺旋霉素）蛋白质（胰岛素肽系抗生素）功能性食品添加剂（维生素）等 聚苯乙烯合成吸附树脂吸附 含有电子的化合物如 含有苯环和共轭双键的化合物 甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附 含羧基、酯基、氨基、酰胺基等与H可结合的官能团的化合物,(五)根据物质的分子大小进行分离,葡聚糖凝胶(sephadex G):水做溶剂羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex L
12、H-20):水或有机溶剂,1 葡聚糖凝胶简介 由葡聚糖凝胶Sephadex G-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附层析、分配色谱和分子筛功能的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。德国科学家Hans Henke著有Sephadex LH-20凝胶色谱分离专著，详尽叙述了Sephadex LH-20在植物化学研究中的应用。,2 原理 分子筛：分子的大小和形状 吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键 分配层
13、析：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定 相（凝胶）之间的分配 3 操作 a 装柱 洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱 b 上样 c 洗脱 水溶性好 水或电解质溶液 水溶性差 醇水或丙酮水 极性较小 丙酮、氯仿,d 浓缩 视情况而定 e 再生 洗脱剂平衡 有污染：0.2N NaOH-0.5N HCl 浸泡 水洗净-平衡 保存：50%丙酮水溶液 4 应用实例 例如，Sephadex LH-20层析分离川穹里的腺嘌呤，贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶，日本附子里的乌头碱，银杏黄酮甙，夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷，升麻中的酰胺苷，水蔓菁中的水蔓菁萜苷，鹿衔草中的鹿蹄草苷，淫羊霍中的羊霍苷，多种中草药中的芦丁芸香苷，红
14、花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮，麦冬中的麦冬黄酮，鹿蹄草中的儿茶素，紫草中的萘醌、多酚。,(六)根据物质解离程度不同进行分离,离子交换树脂:提供可供交换的离子,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,1 原理 利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而进行 的交换性柱层析方法。2 影响离子交换的因素 PH值 欲交换化合物的性质 欲交换化合物的浓度 温度,交换溶剂 交换流速 树脂用量 3 树脂的选择 4 操作 a 树脂预处理 b 装柱 c 上样 d 交换 e 洗脱 f 树脂再生,第四章 结构研究法,二.化合物的纯度测定,1.外观,2.熔点,3.色谱,A.TLC,B.HPLC,三.结构研究的主
15、要程序,一.手段:光谱(主)+化学,未知物,物理常数TLC,分子式,取代基定性定量,骨架特征,取代基定位,平面结构,立体结构,全合成,mp aD,MS+元素分析(EA),IR;UV;1H(13C)-NMR,植化分类光谱特征,NMRMS 化学方法,NMRMS解析,CD ORD NMR(NOE),已知物,化学关联,结构测定,单晶X-射线衍射,数 据 获 取,光 谱 特 征,化学证明,与已知物对照,三.结构研究中采用的主要方法,（一）确定分子式，计算不饱和度,1.元素定量分析配合分子量测定确定分子式,分子式确定：,2.同位素丰度比法确定分子式,3.高分辨质谱（HR-MS),不饱和度计算：,1.电子轰
16、击质谱（EI-MS）,（二）质谱（MS）,2.化学电离质谱（CI-MS）,3.场解析电离质谱（FD-MS),质谱的类型：（根据电离方式分类）,4.快速原子轰击质谱（FAB-MS）,5.电喷雾电离质谱（ESI-MS),普通质谱（MS）,高分辨质谱(HR-MS):同时给出分子式和分子量,质谱图,（三）红外光谱（IR）,伸缩振动-键长的改变,弯曲振动-键角的改变：,IR图谱,UV图谱,b-臧茴香酮的UV图谱,（四）紫外光谱(UV)-判断骨架类型,（五）核磁共振谱（NMR）,1H-NMR图谱,J,化学位移,分子中不同化学环境的同种磁性核由于屏蔽效应所引起的共振使磁场强度发生改变的现象称为化学位移。,2)影响化学位移的因素,(1)化学等价质子,(2)影响化学位移的因素,A.诱导效应,不同电负性原子对CH3质子的化学位移的影响,B.共轭效应,d,4.34.4,4.85.9,5.96.5,1H-NMR图谱,J,
