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1、第二章 提取分离鉴定的方法与技术,第一节 天然药物化学成分的提取方法与技术,提取是指选用适宜的溶剂和适当的方法，将所需成分尽可能完全地从天然药物中提出，而杂质尽可能少地被提出的过程。从天然药物中提取化学成分常用的方法有溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法及超临界流体萃取技术。,一、溶剂提取法,概念：根据天然药物中各化学成分的溶解性能，选用对有效成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，用适当的方法将有效成分尽可能完全地从药材组织中溶解出来。,是实际工作中应用最普遍的方法。,基本原理:是在渗透、扩散作用下，溶剂渗透入药材组织细胞内部，溶解可溶性物质，形成细胞内外溶质的浓度差而产生渗透压，在渗透压的作用
2、下，细胞外的溶剂不断进入药材组织中，溶解可溶性成分，细胞内的浓溶液不断向外扩散，如此反复，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡。,影响提取的因素,1、溶剂的选择和提取的方法是溶剂提取法的关键2、药材的粉碎度3、温度4、时间5、浓度差,遵循“相似相溶”的规律,溶剂的极性与介电常数有关，溶剂的值越大，极性越大。,常用溶剂极性大小顺序：石油醚苯无水乙醚 氯仿乙酸乙酯 丙酮乙醇 甲醇 水,溶剂的分类（按极性大小）通常分三类：水；亲水性有机溶剂；亲脂性有机溶剂。,水强极性，穿透力大，安全、经济、易得；易发霉，不易浓缩。亲水性有机溶剂（极性溶剂）极性较大，能与水互溶，其中乙醇最为常用，提取成分全面，效率高，但
3、易燃。亲脂性有机溶剂（非极性溶剂）极性小，与水不能互溶，具较强的选择性，穿透力弱，毒性大，易燃。,常用溶剂极性大小顺序：石油醚苯无水乙醚 氯仿乙酸乙酯亲脂性有机溶剂 丙酮乙醇 甲醇 水亲水性有机溶剂,溶剂的选择应综合考虑溶剂的极性、被提取成分及共存的其他成分的性质三方面的因素来决定，同时还应兼顾考虑溶剂是否使用安全、价廉易得、浓缩方便等特点。,提取方法,1、浸渍法是将药材用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡一定时间，溶出有效成分的一种方法。优点：（1）不需加热，适用于遇热易破坏的成分。（2）操作简便。缺点：（1）时间长，效率低。（2）水作溶剂易霉变，必要时应加防腐剂。,静态,2、渗漉法是将药材粗
4、粉装入渗漉筒中，连续添加浸出溶剂使其渗过药粉，从渗漉筒下口流出浸出液的一种浸提方法。,优点：（1）不需加热，适 用于遇热易破坏的成分。（2）效率高缺点：（1）溶剂消耗多（2）时间长,动态,3、煎煮法是将药材粗粉加水煮沸，滤过去渣后取煎煮液的一种传统提取方法。优点：（1）操作简单（2）效率高缺点：（1）需加热，不宜提取挥发性成分、遇热易破坏成分。（2）不宜提取含多糖丰富药材。,忌用铁器,4、回流提取法用低沸点有机溶剂加热提取中药成分时，为减少溶剂的挥发损失，保持溶剂与药材持久的接触，需采用回流提取法。,优点：提取效率高缺点：（1）溶剂消耗量仍较大（2）受热时间长（3）操作较麻烦,索氏提取器,5、
5、连续回流提取法是在回流提取法基础上的改进，能用少量溶剂进行连续循环回流提取，充分将有效成分浸出完全的一种方法。,优点：（1）提取效率高（2）溶剂用量少缺点：受热时间长,6、超声提取法是一种利用超声波浸提有效成分的方法。优点：（1）提取时间短（2）无需加热，适于提取对热不稳定成分。适于各种溶剂。（3）提取效率高缺点：设备问题有待解决,二、水蒸气蒸馏法,水蒸气蒸馏法系指将含有挥发性成分的药材与水共蒸馏，使挥发性成分随水蒸气一并馏出，经冷凝分取挥发性成分的提取方法。,（一）适用范围1被提取物具有挥发性；2能随水蒸气蒸馏出而不破坏；3被提取物在水中难溶；4、不与水发生化学反应。天然药物中主要用于挥发油
6、、某些挥发性生物碱、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元的提取。,（二）水蒸气蒸馏装置,三、升华法,升华：某些固体成分在受热时不经液态直接成为气态。升华法：天然药物中的某些固体成分在受热时不经液态直接成为气态，经冷却后又成为固态。,四、超临界流体萃取技术,特点：与经典溶剂提取法比较，不用有机溶剂，而是选用一种称为超临界流体的物质替代有机溶剂提取。常用二氧化碳作超临界流体该技术设备投资大，运行成本高，未普及。,第二节 天然药物化学成分分离精制鉴定的方法与技术,浓缩提取液分离,浓缩(蒸馏)装置,旋转蒸发仪装置,一、系统溶剂分离法,一般24种溶剂，极性由小到大组成溶剂系统，依次分离提取液中不同成分，使各溶
7、解度有差异的成分得到分离。是早年研究天然药物成分的主要方法，现研究未知成分仍常用。,二、两相溶剂萃取法,概念：是指向提取液中加入一种与其互不相溶的溶剂配成两相溶剂系统，利用混合物中各成分分配系数的差异将所需成分萃取出来的分离方法。基本原理：利用混合物中各成分在两相互不相混溶的溶剂中分配系数的不同达到分离的方法。分配系数KCu/CL 混合物中各成分在两相溶剂中，分配系数相差越大，分离效果越好。,（一）简单萃取法,实验室装置：分液漏斗萃取中易发生乳化。破坏乳化的方法有：1、用金属丝搅动；2、抽滤；3、加热或冷冻；4、长时间放置（24小时以上）。,（二）逆流连续萃取法,此法可克服用分液漏斗多次萃取操
8、作的麻烦。利用两溶液比重不同自然分层和分散相液滴穿过连续相溶剂时发生传质。分散相（移动相）：小相液连续相（固定相）：大相液,（三）逆流分溶法（逆流分配法）CCD,是一种高效、多次、连续的分离方法当各成分的K接近时，一般方法不易分离，可选此法。,counter current distribution,（四）液滴逆流分配法（液滴逆流色谱法）DCCC,在CCD法基础上改进。原理与CCD法类似，使移动相形成液滴，通过固定相的液柱实现逆流分配从而分离。,droplet counter current chromatography,三、沉淀法,沉淀法是在天然药物提取液中加入某些试剂，使产生沉淀或降低溶解
9、度而自溶液中析出，从而获得有效成分或去除杂质的方法。如果有效成分生成沉淀，则沉淀反应必须是可逆的；如果无效成分生成沉淀，可以是不可逆的沉淀反应。,（一）酸碱沉淀法,利用某些成分在酸（或碱）中溶解，而在碱（或酸）中沉淀的性质达到分离的方法。酸提碱沉：用于生物碱的提取分离。碱提酸沉：用于酚、酸类成分和内酯类成分的提取、分离。,（二）试剂沉淀法,专属试剂沉淀法：如生物碱沉淀剂、雷氏铵盐等。乙醇沉淀法：利用不同成分在不同浓度乙醇中溶解度差异进行分离。水提醇沉醇提水沉,四、结晶与重结晶法,概念结晶：从非结晶状物质通过处理得到结晶状物质的过程。重结晶：用反复结晶的方法，从不纯的结晶制得较纯结晶的过程。原理
10、利用混合物中各成分对某种溶剂溶解度的差别，使所需成分以结晶状态析出，从而达到分离目的。,溶剂的选择结晶的关键 1与被结晶的成分不发生化学反应。2溶解度：对欲结晶成分热时溶解度大，冷时溶解度小；而对杂质则冷、热均溶或均不溶。3溶剂的沸点适中，若沸点过高，则附着于晶体表面不易除去，过低易挥发损失。,当用单一溶剂不能达到结晶时，可用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。,结晶的条件 1溶剂的选择最重要 2杂质的去除 3有效成分含量4、溶液的浓度5、合适的温度、时间等,结晶的操作提取或分离物 溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤 溶液 放置（冷藏）析晶，过滤 粗结晶重复上述操作（重结晶）结晶,五、透析法,
11、是利用小分子物质在溶液中可通过透析膜，而大分子物质不能通过的性质，使分子量差异较大的物质达到分离的方法。,透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白胶膜、玻璃纸膜等。适用于皂苷、蛋白质等大分子物质的分离。,是利用混合物中各成分沸点不同，搜集不同温度的馏份，达到分离的方法。,六、分馏法,七、色谱法（层析法，chromatography）,是一种分离和鉴定化合物的有效方法，其最大的优点在于分离效能高、试样用量少。对一些结构性质相似的化合物，用经典的萃取法、沉淀法和结晶法等难以分离时，用色谱法往往可以很好地分离。色谱法三要素：固定相、移动相、被分离物质,分类：按固定相、移动相、分离原理、
12、操作方式等分类,硅胶色谱、氧化铝色谱、聚酰胺色谱等,气相色谱、液相色谱等,柱色谱、薄层色谱、纸色谱等,吸附色谱、分配色谱、凝胶色谱与离子交换色谱等,（一）柱色谱法（column chromatography）,将分离材料装入柱形容器中，以适当洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离。最早出现的色谱法根据原理可分为吸附柱色谱法、分配柱色谱法、离子交换柱色谱法与凝胶过滤色谱法等。,、吸附柱色谱法,1基本原理 主要是物理吸附分离依据：相似者易于吸附利用各成分在两相中迁移速度不同达到分离。,2吸附剂（固定相）（1）硅胶 极性吸附剂吸附原理活化：100110加热30分钟去活化,（2）氧化铝：极性吸附剂活化：4
13、00 左右加热6小时（3）聚酰胺：高分子化合物尼龙（4）活性炭：非极性吸附剂,聚酰胺吸附色谱原理,3洗脱剂(移动相)在吸附柱色谱中，对于极性吸附剂，移动相的极性越大，其洗脱能力越强，化合物在色谱中移动的速度就越快；而对非极性吸附剂则相反，移动相的极性越小，其洗脱能力越强。,4被分离物质对硅胶、氧化铝等极性吸附剂来说，对极性大的化合物吸附强，而对极性小的化合物吸附弱，故适于分离亲脂性成分；同理，非极性吸附剂如活性炭适于分离亲水性成分。全面考虑固定相、移动相和被分离成分三者的相互关系，是分离成败的关键。,5操作装柱上样洗脱,、分配柱色谱法,1基本原理 同两相逆流萃取法，两相互不相溶的溶剂一相为固定
14、相，以载体固定，另一相为移动相。载体又称支持剂、担体，在分配色谱中只起支持固定相的作用，对被分离成分无吸附作用，不溶于两相溶剂中，也不与被分离成分发生化学反应。常用硅藻土、纤维素粉等。分为正相分配色谱和反相分配色谱 正相分配色谱：移动相的极性固定相极性 反相分配色谱：移动相的极性固定相极性,2、三要素固定相：反相色谱常用C18、C8硅胶移动相：复合溶剂系统被分离物质3、操作装柱上样洗脱,、离子交换柱色谱法,是利用离子交换树脂上的功能基在水溶液中能与溶液的其他离子进行可逆性交换的性质，以离子交换树脂为固定相，使混合成分中离子型与非离子型物质得到分离的方法。根据功能基性质的不同，树脂分为两大类：阳
15、离子交换树脂能电离出H+，与溶液中的阳离子进行可逆交换；阴离子交换树脂能电离出OH-，与溶液中的阴离子进行可逆交换。,1基本原理 2、三要素 固定相：离子交换树脂可再生 移动相：酸碱盐的水溶液或各种缓冲液 被分离物质,3、操作树脂预处理装柱上样洗脱树脂再生,又称分子排阻柱色谱法、分子筛滤过柱色谱法、凝胶渗透柱色谱法等。是一种以凝胶为固定相分离分子大小不同成分的方法。,、凝胶滤过柱色谱法,1基本原理：分子筛 大分子化合物先被洗脱2、三要素 固定相：凝胶、葡聚糖凝胶 移动相：常用水、酸、碱、盐和缓冲液等 被分离物质：用于大小分子化合物的分离3、操作,原理：吸附和分配固定相 吸附原理：吸附剂 分配原
16、理：支持剂+溶剂移动相(展开剂)被分离物质操作：制板(活化)、点样、展开、显色、计算比移值,（二）薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC),原理：分配固定相 支持剂(滤纸)+溶剂移动相(展开剂)被分离物质操作：点样、展开、显色、计算比移值,（三）纸色谱法(paper chromatography,PC),是在经典的液相色谱基础上发展起来的一种快速分离分析新技术。是采用了高效填充剂，利用加压手段加快流动相流速的一种高效能液相色谱法。分离速度快、效率高、试样分析重现性好，而且试样不需气化，只需制成溶液，即可在室温下进样分析，所以此法应用范围极广。近年来，高效液相色谱法除了在药学、有机化工、环境化学及高分子工业等领域广泛应用。,（四）高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC),是现代应用较广泛的一种分离分析技术。优点：分离效率高、分析速度快、灵敏度高、试样用量少。不足之处：试样需加热气化，不适宜分离高沸点、热稳定性差、极性大的化合物。应用：天然药物中挥发油类成分因其沸点低、易挥发，故气相色谱法特别适宜对其进行分离鉴定和含量测定。,（五）气相色谱法(gas chromatography，GC),
