《用PCR扩增法检测性别课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《用PCR扩增法检测性别课件.ppt（15页珍藏版）》请在三一办公上搜索。
1、用PCR扩增法检测性别,原理,聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA（模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间的DNA片段。人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育，即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域，该区域又称为Y染色体性别决定区（sex
2、determining region of the Y，SRY）。,在SRY基因区域设计特异的引物，如果能够利用PCR技术体外扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性。本实验在SRY基因区域内设计了一对引物，利用引物Y1.5/Y1.6扩增出一239bp的片段。利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值，如结合细胞遗传学的核型分析，通过确认SRY所在区域的缺失或易位，诊断46，XY女性或46，XX男性性反转综合征的患者；通过检测胎儿的性别，预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁隐性遗传病患儿的出生；,通过骨髓移植后Y染色体特异的SRY基因片段的DNA分析是由阳性转为阴
3、性或相反，来判断异性别的骨髓移植程度；多年尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不受降解的影响，因此本实验技术常应用于法医学上尸块或血斑的性别确定；此外，本实验还可用于需要快速、准确、同时需检查大量标本的运动员体检。,一、由微量外周血标本制备模板DNA 试剂与材料：1、细胞裂解缓冲液（SDS；蛋白酶K）2、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比）3、3mol醋酸钠（PH5.2）4、无水乙醇，-20保存 5、70%乙醇，-20保存 6、TE缓冲液,步骤,1、1.5ml Eppendorf离心管中加入细胞裂解液100l。2、取末梢血一滴（约5-10l）立即悬浮细胞裂解液中，37保温
4、2小时。3、加入100l酚：氯仿：异戊醇（25：24：1体积比）混合液，盖紧。轻轻摇混，充分混合；室温15000rpm离心5分钟。4、用开口粗的吸管转移上层水相于新的Eppendorf离心管，按步骤5重复抽提1次。如果水相还混浊，增加一次酚抽提。,步骤,5、转移上层水相，加入10l 3mol醋酸钠（PH5.2）轻摇混匀，再加入250l冷无水乙醇沉淀DNA。室温放置10分钟。6、415000rpm离心15分钟，使DNA沉淀（颗粒化）。7、弃上清，加70%冷乙醇500l轻振混匀，415000rpm离心5分钟。8、弃上清，将Ep管倒置在纸巾上，完全除去水分。将DNA自然干燥。9、加10l TE溶解，
5、制成DNA样品。（进行PCR时，取1l即可）。,二、PCR检测性别 试剂与材料：1、上、下游引物（各5 mol/L）2、模板DNA溶液3、10PCR缓冲液：（高压灭菌）4、dNTPs溶液（2.5mmol/L原液）5、Taq DNA聚合酶（5U/l）6、液体石蜡（高压灭菌）,琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 7、电泳级琼脂糖8、电泳缓冲液：5TBE贮存液 9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4暗存。10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，30%甘油于水中。4贮存。11、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶模和加样孔梳齿。12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。,实验步骤：（一）、SRY基因引物设计
6、 Y1.5 5-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT-3 Y1.6 5-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG-3 扩增DNA片段长度239bp,（二）、PCR反应 1、在0.5ml Eppendorf管中依次加入H2O 59l10PCR缓冲液 10ldNTPs溶液（2.5mmol/L原液）8l（0.2mmol/L）上游引物（5 mol/L）10l（0.5mol/L）下游引物（5 mol/L）10l（0.5mol/L）模板DNA溶液（基因组DNA溶液）1l Taq DNA聚合酶（5U/l）2l（2.5U/100l）总量 100l,2、混匀，短暂离心。3、PCR条
7、件Y1.5/Y1.6PCR扩增条件：变性 955分钟 变性 9475秒 复性 5590秒 延伸 72150秒循环30次。扩增产物冷却至室温可于4保存。,（三）、扩增产物分析（方法参见实验四、琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段）取PCR扩增产物10l进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下检查是否有目的片段扩增出来。通常有239bp区带者为男性，无239bp区带者为女性。1、组装制胶模。用胶带纸将制胶模两端开口封好，水平放置，调节梳齿与制胶模底面的距离，保持0.5-1mm空隙，梳齿用铁夹在一旁固定。2、参照琼脂糖凝胶的分离能力表选择凝胶浓度（一般为0.8%），称取琼脂糖，用电泳缓冲液在沸水浴上
8、或微波炉上将琼脂糖颗粒完全溶解。,3、待胶冷却至50左右，加入溴化乙锭（终浓度为0.5g/ml，每10ml加入1l原液），充分混匀后倒入胶模。注意要避免胶体中产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。待胶凝结后，通常需要在室温中放置30-45分钟（也可用保鲜膜将凝胶包好，置41-2小时以增加凝胶强度），非常小心地移去梳子和胶带纸，将凝胶放入电泳槽。加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶表面1-2mm。4、向DNA酶解管中加入1/10体积的上样缓冲液，充分混合。用微量移液器将样品依次加入加样孔内。注意孔中不得留有气泡，加样时吸管头也不必插入孔中，可对准孔，在孔的上方加样，使样品自然沉入孔内，以避免吹出的气泡将样品冲出孔外。,5、盖上电泳槽盖，接上电源，将电压调至20V，恒压电泳。注意加样孔在阴极，使DNA向阳极方向移动。6、当溴酚蓝泳动到一定位置时，停止电泳。分离大片段DNA时，溴酚蓝可能已泳出胶，可根据二甲苯青的位置判断终止时间。电泳完成后可直接在透射紫外灯下观察结果。7、用加红色滤色镜的相机，光圈放到最大，曝光15-30秒，拍照记录。,
