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1、浆膜腔积液细胞学检查质量控制标签:来源【关键词】 肿瘤;细胞学技术;浆膜腔积液浆膜腔积液常作为某些疾病的伴随症状或首发症状出现，临床常通过浆膜腔积液检查鉴别积液的良恶性、明确病因。目前，浆膜腔积液细胞学检查找到肿瘤细胞，仍是鉴别浆膜腔积液良恶性的一种快速、准确、可靠和经济的首选方法。因常规离心沉淀法检出肿瘤细胞的阳性率仅为33%60%左右12，所以多年来，浆膜腔积液细胞学检查方法不断创新和加强各环节质量控制以提高肿瘤细胞的检出率，受到越来越多的临床实验室的关注。1 分析前的质量控制1.1 标本采集1.1.1 采集方式 对大量浆膜腔积液者应留取最后抽出、带有较多浆膜腔脱落细胞的积液做细胞学检查。
2、薛立福介绍3，在胸腔积液采集中可将先抽入注射器的积液再快速推向胸腔底部，反复数次后抽取送检，可使肿瘤细胞检出率由50%左右提高为80.3%。1.1.2 抗凝 采集脱落细胞学检查标本时应加入抗凝剂，一般多为肝素300U/100mL标本，或用109mmol/L枸橼酸钠(标本与抗凝剂比例为101)，是提高肿瘤细胞检出率的一个重要环节而不可忽视。1.2 送检1.2.1 送检标本量 送检标本量直接关系到可收集到的肿瘤细胞量，多数研究者建议为200mL左右。李志忠等4将116例胸腔积液标本分为100300mL组与510mL组做对比，结果肿瘤细胞检出率分别为83.6%与46.6%，差异显著(P0.005);
3、抽出不足100mL者送检510mL，肿瘤细胞检出率仅为14.3%，除标本量过少外，也与患者的病情相关。李亚红等5将250mL标本静置30min后取底层积液5mL离心沉淀，肿瘤细胞检出率为83.3%，如不静置检出率为52%。值得关注的是不少文献报道不管送检标本量多少，只取520mL离心沉淀1，3，5。笔者建议留取新鲜标本100200mL全部离心沉淀，保证收集到尽量多的肿瘤细胞，这是提高肿瘤细胞检出率的一个关键环节。静置一定时间后取底层标本离心沉淀，虽肿瘤细胞检出率与离心沉淀100300mL标本一致，但因时间延长，细胞形态改变而影响细胞识别及诊断，不应作为最佳选择。1.2.2 送检时间 高自芳等6
4、采用图像分析仪对离体后室温放置15min、30min、60min、90min、120min后的浆膜腔积液细胞形态进行分析，发现15min组细胞结构清晰，核着色深、染色质及核膜清楚;30min与60min组细胞略增大，结构尚清晰，染色质较15min组模糊而核膜尚清;90min与120min组细胞面积明显增大，结构模糊不清，部分细胞破碎，特别是120min组的细胞面积是15min组的3倍。因此认为15min内完成送检、处理、固定最佳，而60min内完成送检、处理、固定仍尚可。考虑送检及实验室内标本处理、固定用时，30min内送检、60min内完成标本处理和固定为必须。1.2.3 送检次数 增加送检
5、次数可提高肿瘤细胞检出率，各文献报道结论一致14，三次及三次以上送检与一次送检肿瘤细胞的检出率差异具有显著性(P0.01)。2 分析过程的质量控制2.1 肿瘤细胞收集目前常用的浆膜腔积液细胞学检查5种收集方法，其方法学的创新和质量控制目的均为提高肿瘤细胞收集率。2.1.1 常规离心沉淀法 离心沉淀的相对离心力(RCF)和血性积液的处理是该方法的两个关键质控环节。不同研究中离心沉淀所用转速、时间各异，转速5003 500r/min、离心时间530min不等。但多数文献未说明离心机的有效离心半径，所以RCF(g)不明RCF(g)=1.11810-5有效离心半径(cm)(r/min)2。尿沉渣检查离
6、心RCF为400g/5min，温氏法血细胞比容测定RCF为2 260g/30min，分离乏血小板血浆RCF为1 570g/10min，分离血清RCF为1 010g/5min左右。恶性浆膜腔积液70%以上为浆液性7，其粘稠度大于尿液而小于血液，浆膜腔积液中肿瘤细胞体积又大于红细胞。因此，收集积液中肿瘤细胞时的RCF为1 000g左右较为合适，时间根据浆膜腔积液性状选择510min。目前国产离心机大部分有效离心半径为1415cm，RCF1 000g时，转速为2 500r/min左右。离心沉淀既要避免RCF过小和离心时间过短收集不到肿瘤细胞，又要避免过大和时间过长导致细胞形态异常变化和破碎。血性积液
7、直接涂片，肿瘤细胞检出率仅为11%7;离心后取白膜层制片811肿瘤细胞检出率50%左右;许成英11用草酸铵1.2g、90%酒精30mL、甘油10mL加水至100mL低渗溶液与胸水11破坏红细胞后，肿瘤细胞检出率由52%提高为86%;支喜兰12比较了蒸馏水、6g/L氯化钠溶液和低渗氯化钾+甲醇+冰醋酸溶液3种破坏红细胞的效果，结果为低渗氯化钾+甲醇+冰醋酸溶液红细胞破坏完全而有核细胞形态保持最好。2.1.2 脑脊液细胞玻片离心沉淀器法 进行浆膜腔积液细胞学检查，标本用量仅为0.10.5mL，低速离心而细胞收集率高，损失少;制片好，细胞形态保持完整易于观察，避免了常规高速离心导致的肿瘤细胞发生变形
8、破碎的可能13。张纪云等14取静置后底层的浆膜腔积液用该法检查40例恶性积液，肿瘤细胞检出率为97.5%，而常规离心法为80%，两种方法相比差异有显著性(P0.05)。该法质控需注意各步骤操作准确和离心速度不能过快。2010年2月张树平等：浆膜腔积液细胞学检查质量控制第1期2010年2月河北北方学院学报(医学版)第1期2.1.3 密度梯度离心法 朱任之等1516将抽取的胸腔积液离心沉淀后，以适量PBS混悬后，加到两倍量的淋巴细胞分离液(比重1.055)的表面，2 000r/min离心1520min，收取细胞分离液表面细胞层检查，并依检测结果决定检测次数，最多3次。36例恶性胸腔积液的肿瘤细胞检
9、出率达91.7%，而常规离心法为44.1%(P0.005)。叶安霞8、马吉勇等16用无钙、镁离子Hanks液洗涤处理离心沉淀物后混悬，加入到淋巴细胞分离液表面后离心沉淀，一次检测结果的阳性率分别为78%和65%，均高于常规离心法的30%和45%。三位作者肿瘤细胞检出率相差较大，可能为其检测次数不一致所导致。2.1.4 肿瘤细胞采集器法 又称膜式肿瘤细胞采集术或一次性肿瘤细胞采集器法。该法使用的采集器由入液管、浓缩器、单向阀、三通及出液管组成，其中浓缩器中部夹有微孔滤膜，微孔直径为10m。肿瘤细胞直径一般均大于10m，而淋巴细胞、红细胞因直径小于10m被滤过。浆膜腔积液经抽滤后，取下微孔滤膜涂片
10、。因该法不用离心沉淀，又可处理较大量积液收集肿瘤细胞，无大量淋巴细胞和红细胞干扰，背景清晰，肿瘤细胞检出率明显提高。该法适用各类体液和冲洗液的细胞学检查，因其快速简便而常用于术中浆膜腔积液、灌洗液细胞学检查，肿瘤细胞检出率明显高于常规离心法(P0.005)，多在70%90%之间1720。该法已被国内各级临床实验室广泛采用。该法的标本送检量和标本抗凝对提高肿瘤细胞的检出率至关重要，并要避免抽滤时和滤过膜细胞面涂片时用力过大或不均引起细胞变形。2.1.5 液基细胞学技术 液基细胞学技术于1996年5月获美国FDA批准用于妇科细胞学检查，我国在1998年引进。目前使用的液基细胞学技术有两种21，即新
11、柏氏液基薄层细胞学检查(Thinprep cytology test，TCT)和自动细胞学检查(autocyte prep cytology tset，又称Liqiudbased cytology test，LCT)两种系统。TCT与LCT的制片原理略有不同，TCT是通过高速旋转将细胞打散，然后吸附到具有35万个小孔(孔径58m)的过滤膜上去除杂质后，利用静电吸附原理将细胞制成直径20mm薄层涂片。LCT是利用不同类型细胞的比重差异，将分层液加到保存液中，用离心机离心，将有诊断价值的细胞、病原体与标本中的粘液、淋巴细胞、红细胞分离，把筛选出的细胞制成直径13mm薄层涂片。国内已有不少医疗机构的
12、临床实验室将液基细胞学技术用于浆膜腔积液细胞学检查。该方法仍需先用常规离心沉淀法收集细胞，将沉淀物清洗一次后加入Cytolyty液中。由于该法所制成的涂片总体采集量增加，细胞集中、完整，读片面积小和背景清晰，肿瘤细胞检出率明显提高，与常规离心法比较差异有显著性(P0.01)2224。质量控制的关键环节为取材的质量，包括部位选择、手法轻重等因素，取样不足是液基细胞学假阴性诊断的最主要原因;其次是标本中因血液、粘液多而不做处理，使制片质量不理想，出现假阴性结果25。通过对5种细胞收集方法的比较，作者认为以肿瘤细胞采集器法优点最多，包括简便、快速、经济、处理标本量大和可消除背景干扰，使肿瘤细胞检出率
13、明显提高，适合多种体液的细胞学检查等，建议作为浆膜腔积液细胞学检查肿瘤细胞收集的首选方法。其次为脑脊液细胞玻片离心沉淀器法。常规离心法在做好从标本采集开始各个检查环节的质量控制的基础上，仍可为浆膜腔积液细胞学检查的一种较好方法。该法还可通过对其他细胞及特殊结构的观察，帮助判断积液的性质。密度梯度离心法，操作相对繁琐和同样需对各检查环节进行严格质量控制。液基细胞学技术优点突出，但需专门设备和检查成本升高，且用于浆膜腔积液细胞学检查的时间还不长，值得我们今后做更多的探讨。2.2 制片方法及制片数量离心沉淀物或抽滤浓缩物的制片方法有涂抹法、压片法、推片法和自动细胞离心涂片机法。涂片、压片法易致厚薄不
14、均，细胞重叠而影响观察，楼焕进25建议推片为好，还有的作者建议推厚涂片和薄涂片各数张4。高质量的制片是后期染色及形态学观察的良好基础。制片数量 增加制片及检查数量，可提高肿瘤细胞检出率。一般文献均为310张4，7，9，26，至少2张11。2.3固定 制片后固定与染色方法相关，一般HE染色均需专门进行固定，固定的好坏直接影响到染色效果及镜检诊断。HE染色的固定液有几种配方及固定时间：无水酒精(或5%酒精)/15min;甲醇冰醋酸(3：1)/20min;95%酒精乙醚(11)/15min;95%酒精乙醚冰醋酸混合液(50501)/15min;AAF/30min;400g/L甲醛/5min。混合类固
15、定液固定效果更好。2.4 染色 细胞染色方法有HE、瑞姬氏染色和巴氏染色等，使用HE染色占第1位，其次是瑞姬氏染色。2.4.1 瑞姬氏染色(或刘氏染色) 该染色方法简单、试剂易得，除对肿瘤细胞的染色效果好使之易识别外，还对浆膜腔脱落的间皮细胞、各种血细胞、淋巴瘤细胞、细胞的吞噬现象、免疫岛、红斑狼疮细胞、血细胞黏附肿瘤细胞花环现象、真菌、寄生虫有较好的染色效果而易识别，对分析鉴别积液性质和判断预后很有帮助2728。如由检验科负责，多用瑞姬氏染色。2.4.2 HE染色 病理学检查多用此染色法，优点为细胞核结构清晰。浆膜积液细胞学检查由病理科负责，习惯用此染色。两类染色方法各有其优点，质量控制的要
16、点均为染液的配制质量和制片的质量。笔者推荐一般基层医院用瑞姬氏染色方法。2.5 镜检 镜检观察是检查的最后关键环节，应仔细认真完成。一般要求二步扫描法4，26：先用低倍镜扫描观察全片：重点对涂片尾部及边缘部位进行观察;发现可疑细胞后，转换油镜鉴定细胞性质。每份标本至少镜检23张涂片，如未找到肿瘤细胞分类计数500个有核细胞，分析判断积液性质。据吴茅等29通过浆膜腔积液细胞涂片照片调查84家二、三级医院的临床实验室，第一次对肿瘤细胞、淋巴瘤细胞、核异质细胞、多倍体细胞识别的正确率分别为57.4%、26.2%、26.2和30.4%，经培训后，第三次调查分别提高为67.5%、54.4%、53%和54
17、.4%，说明了浆膜腔积液内细胞识别能力低是国内各级医院临床实验室普遍存在的问题。3 建议3.1 必须加强浆膜腔积液细胞学检查的分析前质量控制工作，由医疗机构牵头制定规范性的操作规程，加强分析前的标本采集、抗凝、送检时间、次数等各重点环节协作和质量控制工作。3.2 优选浆膜腔积液中肿瘤细胞的收集、检查方法为浆膜腔积液细胞学检查质量控制的首要任务。各实验室应根据自身的条件，积极引进肿瘤细胞检出率高的方法，并制定相应严格的操作规程，加强质量控制。在标本处理、制片、固定、染色、镜检各个环节上严格遵守操作规程。3.3 建议各级临床检验中心大力开展浆膜腔积液细胞学检查的室间质量评价活动，并开办相关的培训班
18、、研讨班，特别要加强对浆膜腔积液内细胞识别能力的培训，尽快提高临床实验室浆膜腔积液细胞学检查的质量。【参考文献】1 樊英，李龙芸.良恶性胸腔积液的鉴别诊断J.癌症进展杂志，2005，3(2)：134136.2 李桂宾，孙玉红，高颖.良恶性胸水的实验室检查新进展J.临床肺科杂志，2005，10(3)：361362.3 薛立福.恶性胸腔积液检测方法及评价J.中华结核和呼吸杂志，2001，24(1)：1819.4 李志忠，刘锡范，李新香.胸腔积液细胞学检查方法的对比研究J.中华全科医师杂志，2004，3(1)：76.5 李亚红，李亦民，袁古治，等.改良胸水常规细胞学检查的临床应用价值J.临床医学，2
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