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1、如何进行IVF实验室的质控广东医学2010年10月第31卷第l9期GuangdongMedicalJournalOct.2010,Vo1.31,No.19如何进行IVF实验室的质控刘东云,韩伟,黄国宁重庆市妇幼保健院生殖与遗传研究所(400013)体外受精与胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVFET)是治疗不育症的有效手段,IVF实验室是其中极为重要的部分,对IVF结局有重要影响.在体内,配子和胚胎处于一个无光,恒温,恒湿,低氧的环境,母体内分泌及子宫/输卵管内分泌环境极其复杂,配子/胚胎在受到母体自身保护的环境下生长发育.但在体外,配子/
2、胚胎自身不具备任何屏障和保护功能,可能暴露于含有害气体的空气中,面临温度,渗透压,pH等变化的应激,削弱胚胎的发育潜能.严格的实验室质量控制(qualitycontrol,Qc)与质量保障(qualityassurance,QA)系统为配子和胚胎的生长发育提供了相对稳定的场所,建立稳定,可靠的IVF实验室对于维持IVF成功率具有重要作用.质量控制系统包括质量控制和质量保障,已常规用于临床诊断检验实验室日常工作,在IVFET中全世界范围内也逐步引进了质量控制系统,以确保实验室操作的稳定性及最大限度地维持胚胎发育潜能,以及获得最好的胚胎质量和最高的妊娠率.1IVF实验室的质量控制IVF实验室质量控
3、制包括两方面:一是严格的操作制度及管理制度,避免因不恰当操作而造成失误,二是对接触配子和胚胎的耗材,培养基进行质控实验,以决定是否采纳这些耗材及培养基.IVF实验室的QC系统不仅确保结果的稳定性,而且可以追踪实验室操作事件.1.1质量控制制度IVF实验室作为操作人类配子/胚胎的空间具有其自身的特殊性,工作人员应明确地被告知哪些必须做,哪些禁止做.例如必须做到以下事项:进入培养室的人员必须严格遵守培养室规章制度;每天工作前半小时开启超净工作台,热台,热板,空气净化设备并测试所有培养箱的CO,浓度,温度,操作台面和热板的温度;每天记录实验室内外的温度,湿度,包括天气情况;记录实验室内外出现的异常情
4、况,包括异常味道,装修,大范围消毒,毒气泄漏事件等;每天上下班时检查培养箱运行状况及气体供应情况,及时更换气瓶;每天工作结束时关闭所有照明灯,操作台,显微镜,热板,烤箱,电脑等电器的电源;精液接收,处理,采卵,授精,移植,冷冻,解冻等对配子/胚胎操作必须由2名实验室人员核对并签名;配子/胚胎冷冻和解冻须严格编号和记录,双人核对患者夫妇姓名,储存位置,冷冻时间,胚胎期,胚胎数目,冷冻管数等.禁止做以下事项:禁止在同一操作区内同时处理2例或2例以上患者的配子/胚胎;禁止不同患者的配子/胚胎使用同一支吸管操作;禁止同时交接或处理2份或2份以上的标本,发现患者身份可疑,或标本混乱,必须立即停止操作,核
5、实身份,混乱的标本,用品一律废弃;禁止将对胚胎有毒的化学物质和放射源带进胚胎实验室;未经患者本人同意,禁止使用其配子或胚胎进行科学研究;禁止无医学指征的性别选择.1.2质量控制实验鼠胚实验(mouseembryoassay,MEA)是目前最常用于实验室耗材,培养基和设备质量控制的生物方法.MEA方法不同检测的效率也不同.单细胞鼠胚对培养环境毒素更灵敏.鼠系也可能影响检测敏感性,远亲杂交鼠胚胎在特定培养基中可能停滞于2细胞期,所以近亲杂交鼠胚更敏感.是否添加氨基酸和白蛋白也可能影响MEA的敏感性,因为它们可以螯舍毒素从而降低鼠胚对检测物质的敏感性.所以理想的MEA方法是使用近亲杂交鼠从舍子期开始
6、,在不含氨基酸的简单培养基加白蛋白中培养,从合子期培养到2细胞期,然后在不合白蛋白的简单培养基中继续培养至囊胚期以防止掩盖毒素的存在,检测通过标准由各实验室自己规定,一般以80%或90%以上囊胚形成率为标准.MEA适用于新建或新启动周期的F实验室质控.除MEA外,可通过培养24,78,96h动态观察胚胎形态,了解囊胚发育,形态差异及延迟,细胞数,细胞分布(内细胞团和滋养外胚层)和出生率,这些都是实验室质控最有效的数据,这些数据不仅反映胚胎发育的情况,而且反映囊胚的存活潜能.精子存活率实验具有简单,易操作的优点,由于鼠与人的种属差异,MEA不宜在IVF实验室常规开展,精子存活实验则作为常用的质控
7、实验.正常人精液上游法分离所需精子,调节活精子密度为510.?mL-.,置5%CO,37培养箱培养72120h,计算生存指数(生存指数=测试组活精子数/对照组活精子数100%),生存指数>70%实验有意义,85%为合格.120h精子存活实验对实验室环境因素具有更好的灵敏性.这种方法使用的是人精子,材料易得,操作简单,但对其敏感性及对人胚胎的直接相关性还有疑议.内毒素测定方法需要使用生物酶活性测定,这种检测方法超出常规IVF实验室的操作范围,需要由有资质的检测人员或部门来进行.常见的内毒素来源是纯化水,如果IVF实验室自制培养基,一定要定期检测水和培养基的内毒素水平.商品化的培养基一般都已
8、经通过内毒素检测并有证书表明内毒素水平低于最低可接受水平.pH检测也是培养基质控试验的一个重要部分,检测pH水平前需要将培养基平衡过夜,商品化的培养基附有证书标明pH范围,各公司培养基及所建议的pH正常范围略有区别,因此使用时应参照说明.如果培养基超出预计pH范围应停止使用该培养基,查明原因并纠正偏差.1.3实验室空气的质量控制实验室空气质量难以控制,但至关重要.空气质量对IVF结局的影响可从受精失败至广东医学2010年10月第31卷第l9期GuangdongMedicalJournalOct.2010,Vo1.31,No.19胚胎发育延迟及降低发育潜能,且这种影响可能不表现在胚胎形态改变上.
9、空气质量可受实验室内,外因素影响,进入实验室的空气须尽可能经过高效过滤膜(HEPA)过滤,为减少实验室天花板和墙壁外界空气进入,应注意天花板,照明接缝处的密封.储存物品区域应设置在实验室独立的区域,尤其是新消毒的物品,它们可能释放多种有害化合物.即使被严格地限定,胚胎实验室邻近的外部活动仍可能影响实验室内空气质量.当空气质量受外部活动的影响后,可以采取一些手段减少空气质量的下降,如增加更换HEPA滤膜的频率或培养箱使用经过质量认证的气体,最大限度地保护培养室环境的空气质量.培养箱的空气大部分来源于实验室,依赖于实验室内气体环境,所以维持实验室内优质的空气质量也会有利于培养箱内的空气质量.另外,
10、气体的质量和来源也应视为培养环境质量的一部分.这些气体的制造者通常不了解IVF实验室对空气质量的高标准要求.气体管道应使用尽可能短的塑料或橡皮管以减少因泄漏而对气体浓度的改变,以及使用含碳滤膜吸附空气中挥发性物质.有文献报道培养箱内使用特殊的滤膜纯化进入培养箱的空气,可能改善箱体内的空气质量.近来一些协会和机构强烈建议常规连续评估IVF实验室培养环境,实验室操作程序中应包括室内质控过程,如精子存活实验或鼠胚实验.1.4培养箱的质控胚胎体外培养的大多数时间是在培养箱渡过,培养箱的质量直接影响配子/胚胎的体外培养结果.每天须检测培养箱CO,O,浓度及温度.检测时须使用高灵敏度,经严格校正的仪器,L
11、abtect检测仪用于CO浓度检测的准确性为4-0.2%.红外线探头的电子检测仪的灵敏度也可达到0.2%.使用哪种仪器取决于实验室能够接受的限定值.每天开始工作或检测前,第1次开启培养箱门前须记录培养箱温度,气体显示值.开启箱门会改变培养箱内环境,有研究显示开启箱门后CO浓度恢复需要1h,温度恢复需要20min.越频繁开启箱门,胚胎培养内环境越不稳定.GARDNER等研究发现频繁开启培养箱门可导致鼠囊胚细胞数减少.同时温度的升降也会影响胚胎发育潜能.减少箱门开启次数的方法包括:将胚胎培养和试剂准备的培养箱分开,大型培养箱有不同的舱门也能减少反复开启箱门的影响.我中心采用的方法是一对一培养,即1
12、例患者的胚胎放置在l台培养箱中培养,可以最大限度地减少培养箱门开启次数.矿物油覆盖培养基可降低体外操作过程中CO,浓度波动导致的pH快速(12rain)明显升高,但矿物油不能防止CO,丢失,只降低了CO弥散率,所以应尽可能缩短培养箱外操作时间,如果操作时间超过5rain,应使用MOPS缓冲培养基.2IVF实验室的质量保障系统质量保障系统是质量体系中全部过程,包括质量控制过程,使其产品及服务满足其质量特征.质量控制是质量保障的前提,质量保障是质量控制的目的.建立完善的质量控制与质量保障体系是一个漫长,辛苦的过程.质量保障的目的是确保每个步骤无论由哪个工作人员操作,都能恒定在同一水平上.2.1人类
13、辅助生殖技术的管理机构欧关发达国家多有相应的管理机构对实验室进行定期检查与指导,如美国生殖医学学会(ARSM),关国病理学院(CAP),美国辅助生殖技术学会(SART),美国生物分析学委员会(ABB),英国人类受精与胚胎权威机构(HFEA),英国临床胚胎学协会(ACE),澳大利亚生殖医学会(FSA),澳大利亚生殖技术鉴定委员会(RTAC).上述管理机构对辅助生殖技术实验室提供了行业规章制度准则与建议.规章制度的实施是通过实验室及专业技术人员核发执照与证书,对实验室进行定期检查与检测而进行.美国还规定每一例体外受精与胚胎移植的病例都需要上报给美国疾病控制中心(CDC),美国CDC每年1次公布全关
14、所有辅助生殖技术中心2年前所有病例的成功率,任何专业人员或普通公民都可以从CDC网站获取这些数据.卫生部从2001年颁布了人类辅助生殖技术管理办法,开始对全国体外受精与胚胎移植及精子库进行规范化管理,取得了显着成效,2007年转由省卫生厅审核批准,目前估计全国约近200所生殖中心已通过卫生部审批,允许开展人类辅助生殖技术.2.2质量保障体系的建立IVF实验室需要一套严格的质量保障体系.实验室内进行的每一个技术环节(例如ICSI受精率,冻融胚胎存活率,胚胎着床率,妊娠率等)都需要定期的数据统计与分析,以追踪每一名技术人员的业务水平与效率.质量保障系统需要一些检测方法和手段以及详细的员工训练计划.
15、质量保障体系的内容包括:质量保障体系内容,人员行为管理规范,严格的:l,JL/实验室操作规范及操作手册(SOP),每天交接班,术前讨论,月质量控制总结与讨论,年质量控制总结与讨论,突发事件分析与讨论,建立个人技术档案,奖惩制度.IVF实验室管理过程中,应对每一件仪器或技术程序的技术标准和该仪器或技术程序的质量控制数据进行定期分析比较,并采取必要的修正改进措施.质量保障系统必须由指定的专人负责执行,并有详细的书面计划章程,以便执行质量保障的人员有章可循.在日常工作中,每个月定期总结2个月前所有助孕周期资料,包括患者基本资料,COH,获卵数,获成熟卵数,生化妊娠,临床妊娠,不同年龄段成功率比较,不
16、同不育原因成功率比较,并发症,不同用药方案比较,不同促排卵药物比较等,每年总结全年质量控制总结与讨论,在发生成功率降低或波动时,应立即组织所有医师,技术人员,护士分析原因,提出改正方案,并记录突发事件分析与讨论结果.每一名技术人员建立完善的技术档案,记录工作量,发表文章,进修培训开会记录,授课带教记录,差错记录及当事人情况说明记录,奖惩记录.逐步建立完善的IVF实验室质量保障体系.2.3辅助生殖实验室质量保障方法辅助生殖实验室质量保障体系大致分为人员质量保障,仪器质量保障,试3,1/消耗品质量保障和操作程序的质量保障.辅助生殖实验室应有明确的人员编制,每个职位应有明确的要求标准和责任范围,对新
17、聘人员应有明确的培训方案,在职员工也应有明确的在培训技术,不断更新技术人员的知识水平和提高技术.对每一名员工参照其标准要求和责任范围应建立明确和具体的方案定期监督工作表现和技术能力.对技术人员之间的操作差异要定期检查,如定期比较2名技术人员对同一精液标本的分析结果,差异不能超出规定的范围.对每一名技广东医学2010年1O月第31卷第19期GuangdongMedicalJournalOct.2010,Vo1.31,No.19术人员的技术水平如ICSI,胚胎复苏率要有检测记录,并利用LeveyJennings图或Cusum图记录,监督每名技术人员的表现.辅助生殖实验室须指定专人负责审查仪器设备的
18、日常监测结果和维修调试的实施,每件仪器设备须定期维修调试,对冷冻仪,显微操作仪等关键性仪器设备,须有意外情况下的应急措施,包括备用仪器及自备发电机及电池等.详细记录仪器故障,维护修理及应急措施.指定专人负责定期审查试剂/消耗品的日常监测结果和保管措施,对试剂/消耗品的异常发现要有详细记录并采取相应的纠正或补救措施.辅助生殖实验室的操作程序管理方法,必须有书面的具体,可操作性的程序化操作手册(SOP),对SOP的要求是:一个具备一般专业常识的人在无人指导的条件下能够按照SOP介绍的操作方法基本完成相关程序.根据临床经验设立各项技能操作的限定值,例如IVF受精率,ICSI受精率,卵裂率,胚胎形成率
19、,可移植胚胎率,优质胚胎形成率,囊胚形成率,胚胎冷冻率,冻融复苏率,临床妊娠率等.定期分析总结各项指标,发现超越限制(上升或下降),回顾性分析总结原因,定期根据临床结果调整限值,辅助生殖技术的主要临床指标包括临床妊娠率,自然流产率,继续妊娠率,出生率.质量控制与质量保障体系是一个长期的过程,没有终点.没有建立质量保障体系的快捷方式.规模较大的生殖中心一般需要810年才能建立一套有效的质量保障,但也有一些规模较大的生殖中心在23年内成功建立的案例.为了确保为患者提供最高效最安全技术服务的目的,辅助生殖实验室必须建立严格的质量控制与质量保障体系.参考文献1GARDNERDK,REEDL,LINCK
20、D,eta1.QualitycontrolinhumaninvitrofertilizationJ.SeminReprodMed,2005,23(4):319324.2MERTONJs,VERMEULENZL,OTrERT,eta1.CarbonaetivatedgasfiltrationduringinvitrocultureincreasedpregnancyratefollowingtransferofinvitroproducedbovineembryosJ.Ther-iogenology,2007,67(7):12331238.3AVERYB,MELSTEDJK,GREVET.Ano
21、velapproachforinvitroproductionofbovineembryos:useoftheOxoidatmospheregeneratingsystemJ.Therigenology,2000,50(8):12591268.4FUJIWARAM,TAKAHASHIK,IZUNOM,eta1.Effectofmieloenvironmentmaintenanceonembryocultureafterinvitrofertilization:comparisonoftoploadminiincubatorandconven-tionalfrontloadincubatorJ.
22、JAssistReprodGenet,2007,24(1):59.5GARDNERDK,LANEM.Alleviationofthe2一cellblockanddevelopmentottheblastoeystofCF1mouseembryos:roleofaminoacids,EDTAandphysicalparametersJ.HumReprod,1996,11(12):27032712.(收稿日期:2010816编辑:王冰)男性不育症的ART治疗策略及展望褚庆军南方医科大学南方医院生殖医学中心(广州510515)男方因素占不育夫妇病因的50%,在临床工作中有大约50%的男性不育患者找不
23、到明确的病因,因而给治疗带来极大的困难.近三十多年来,随着辅助生殖技术(artificialreproductivetechnique,ART)的广泛开展,为不孕不育夫妇带来了巨大福音.尽管许多患者的不育原因仍未能明确,但通过ART能使99%的男性不育患者成为生物学父亲.但是,在临床实际工作中,常易出现两类错误,一是不恰当的无限期采用缺乏循证医学证据的保守药物治疗,导致错失ART治疗的最佳时机,二是轻易放弃可经养生,药物或手术治疗而获得自然受孕的机会,过度使用ART治疗.1ART方法简述辅助生殖技术是指对配子,胚胎或者基因物质进行体内外系统操作获得新生命的技术.其过程主要是医务人员应用非自然性
24、交方式操控精子,卵子,授精及胚胎以满足不育夫妇的生育要求.目前最常用的辅助生殖技术包括人工授精(artificiMinsemination,AI),体外受精与胚胎移植(invitrofertilizationandembryotransfer,IVFET)及其衍生技术,如卵胞浆内单精予显微注射(intrcytoplasmicsperminjection,ICSI)及植入前遗传学诊断(preimplantationgeneticdiagnosis,PGD)等.下面略述ART的主要方法.1.1AI指男性用非性交方法排精(体外排精)后,将精子优选处理,把它们置入女性生殖管道内,使精子和卵子在体内结合
25、,授精,从而妊娠的方法.按精子来源不同分为:夫精人工授精(AIH)和供精人工授精(AID);根据精液置入女方体内部位不同又可分为:宫颈周围或宫颈管内人工授精(ICI)或宫腔内人工授精(IUI).1.2IVFET及其衍生技术人工授精发生在女方体内,临床应用有其局限性.1978年第1例通过体外受精婴儿的诞生才使得辅助生殖技术取得了根本的进步.这是真正意义的人体外卵子,精子结合受精方式,也是目前治疗不育症最有效的辅助生殖方法.ICSI指将一个活的精子透过透明带及胞膜注射到正常成熟的卵细胞内被动地完成授精过程.PGD指将体外受精后发育的胚胎取部分细胞行致病基因检测,筛选正常基因的胚胎后进行移植,可预防许多遗传病的发生.2ART适应证目前各生殖中心常用的ART方法主要包括AI,IVF
