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1、第一节 高效液相色谱的定义,定义,高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在色谱柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录色谱信号。,第二节 仪器装置,所使用的仪器为高效液相色谱仪，基本是由高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、数据采集及处理等几部分构成。仪器应定期检定并符合有关规定。,高压输液系统,高效液相色谱输液系统包括贮液罐、高压输液泵、梯度洗脱装置等。,贮液罐及流动相,贮液罐 贮液罐是一个存放流动相（洗脱液）的容器,所以其结构材料必须对流动相是化学惰性的。常用的材料为玻
2、璃、不锈钢或表面喷涂聚四氟乙烯的不锈钢等。容积一般为0.52升。,流动相 流动相的配制应首选色谱纯试剂，水应用纯化水。流动相使用前应先用0.45m或更小孔径微孔滤膜过滤，目的是除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。其次，流动相进入高压泵前应脱气，目的是除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡，如果不去除气泡，会有以下情况发生：（1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积；（2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形；（3）检测器中的气泡产生基线波动。脱气的方法有加热法、加压法、超声去除法、惰性气体置换法及在线脱气法。,反相色谱系统的流动相首选甲醇水系统（采用紫外末端波长检测时
3、首选乙腈水系统）。乙腈与甲醇相比较，具有以下优点：（1）乙腈洗脱能力较强（40%乙腈约相当于50%甲醇，相当于30%四氢呋喃）；（2）乙腈具有良好的溶解能力，能使色谱峰的峰形更加对称；（3）乙腈与水能够较好的互溶，并且黏度较甲醇水小；（4）乙腈的截止波长是有机溶剂中最低的，高纯度乙腈截止波长为190nm。,但同时具有以下缺点：（1）乙腈价格较甲醇昂贵；（2）在低pH条件下，磷酸盐在乙腈溶液中溶解度较小，有研究表明，当乙腈接近50%（体积分数）且磷酸盐缓冲盐达0.050mmol/L时会生成沉淀，而且这种沉淀是逐步形成的；（3）乙腈不很稳定，易与强酸反应，如硫酸；（4）与醇类溶剂相比，乙腈毒性较大
4、，但在正常操作下，基本是安全的。,如经试用不适合时，再选用其它溶剂系统。如在上述二元流动相中加入少量的四氢呋喃，能够改善某些难分离的物质的分离度，还可加入少量有机碱类（如三乙胺等）可改善色谱峰峰拖尾现象。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。另外，由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。,高压输液泵,高压输液泵是高效液相色谱仪中的关键部件之一。它将洗脱液在高压下连续不断地送入柱系统，使样品在色谱柱
5、中完成分离过程。在高效液相色谱仪中,对高压输液泵的性能有如下要求：1.流量稳定。为使色谱过程具有良好的重现性,泵的输出流量要恒定。其流量精度为1%左右。2.输出压力高。由于色谱柱填料颗粒细,为使洗脱液以一定的流速流过色谱柱,泵必具有一定输出压力。不同的仪器，所使用的输出压力单位不同，最高的输出压力为500kg/cm2。另外,输出压力应平衡,脉动小,有利于降低检检测器的噪音,提高信噪比和柱效。,3.流量范围宽。流量可调范围大,一般在0.0110ml/min范围内任选。4.耐酸、碱缓冲液腐蚀。5.泵体易于清洗。具有梯度洗脱功能，操作方便，容易维修。,目前在高效液相色谱仪中所采用的高压输液泵,按排液
6、性质可分为恒压泵和恒流泵;按工作方式又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种。前两种为恒压泵,后两种为恒流泵。目前在高效液相色谱仪上采用最广泛的为往复柱塞泵。,由驱动机构(马达、减速器、驱动凸轮)带动的小柱塞(34mm),在以密封环密封的液缸内，以每分钟数十次至一百多次的频率作往复运动。当小柱塞自液缸内抽出时,出口单向阀由于管路中液体的外压力迫使它关死,液体自入口单向阀吸入液缸;当小柱塞被推入时,入口单向阀关死,液体经压缩自出口单向阀排出,如此周而复始,压力逐渐上升。泵的输出流量,可借柱塞往复运动的冲程或马达的转速来调节。由于泵的柱塞往复运动的频率较高,所以对密封环的耐磨性及
7、单向阀的刚度和精度要求很高。密封环一般采用聚四氟乙烯加添加剂材料制造,而单向阀的球、阀座及柱塞杆则用人造红宝石材料。,往复柱塞泵因为它的液缸容积小,易于清洗和更换溶剂系统,因此特别适合于梯度淋洗,现已广泛应用于高效液相色谱中。但由于泵体本身的结构,决定了它的输出压力是随柱塞运动位置的变化而变化的,因此输出压力有明显的起伏脉动。为了克服此缺点,目前仪器中使用的泵,大致用以下几种方法减少它的压力脉动。采用多头泵(二头或二头以上)交替联动压力脉动阻滞器改进驱动凸轮的几何形状,梯度洗脱装置,梯度洗脱,又称溶剂程序。在色谱分离过程中,洗脱液的组成按一定的速率连续改变,其作用相当于气相色谱中的程序升温。由
8、于液相色谱中洗脱液的极性变化直接影响样品组分的保留值(或k值),因此梯度洗脱可改善复杂样品的分离度,缩短分析周期,改善峰形和提高样品的最小检测量。一般在液相色谱中,梯度洗脱比程序升温、流速程序、重复分离和联用柱等几种方法有效得多。梯度洗脱装置可分为以下两类:,1.低压梯度洗脱装置 低压梯度又称外梯度。它是一种在常压下洗脱液按预先规定的比例混合后,再由高压泵输入色谱柱,所以也称为泵前混合。最简单的低压梯度装置。是利用两个直角三角形容器,其几何位置不同,两种洗脱液的混合比例曲线也不同。由于其重复性差,现已很少采用。电磁比例阀的开关频率,由控制器控制。改变控制器程序,即可得到任意混合浓度的曲线。,2
9、.高压梯度洗脱装置 高压梯度又称内梯度。它是将溶剂经高压泵加压后再混合的梯度洗脱装置。常见的一种是由两台高压泵、梯度程序控制器、混合器等部件组成。两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器,经充分混合后进入色谱柱。这是一种泵后高压混合形式。高压梯度所采用的泵,多为往复柱塞泵或螺旋泵。由此所获得的流量精度高,梯度洗脱曲线重复性好。梯度洗脱的溶剂混合器应具备容积小、无死区、清洗方便、混合效率高等性能，才能获得重复的、滞后时间短的梯度洗脱曲线。,3.注意事项（1）溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差；（2）梯度混合的溶剂互溶性要好；（3）梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收
10、检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）。,进样系统,进样系统是将被分析试样导入色谱柱的装置。对于液相色谱的进样装置，要求重复性好，死体积小，保证中心进样,进样时对色谱柱系统流量波动要小，便于实现自动化等。进样系统包括取样、进样两个功能,而实现这两个功能又分手动和自动两种方式。,柱温箱,柱温箱为放置色谱柱的地方，一般可以存放13根色谱柱。应用柱温箱可以保持色谱柱温度，不受外界环境影响，主要表现为分析结果重现性好、提高柱效、降低柱压、保证检测稳定性。较为先进的柱温箱不但可以保持较高温度（80100），也可以保持较低温度（低于室温10），同时可设置温度
11、程序控制。,色谱柱,色谱柱是高效液相色谱仪的核心部件，要求分离度高、柱容量大、分析速度快。要达到如此好的性能，不仅与固定相本身的性能有关，而且与色谱柱结构、装填和使用技术等有关。,色谱柱的使用及保养,1.使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。2.以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40，为改善分离效果可适当提高色谱柱使用温度，但不宜超过60。,检测器,高效液相色谱法具有高效、高速、高灵敏度的特点。微量组分经色谱柱分离后的检测既不能用人的肉眼也不
12、能分段取样后用仪器检测，只能采用检测器在色谱柱后直接检测。样品组分洗脱液中的浓度或物理量变化，由检测器连续地转换成电信号，在记录仪上迅速地给出直观的信息。操作者可按照所描绘的色谱峰位置来定量地判断分离情况的优劣,并根据峰面积定量地测定各组分的含量。,最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器和质谱检测器等。,馏分收集器,如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做了其他波谱鉴定,或获得少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的。用小试管收集、手工操作，只适合于少数几个馏分，手续麻烦，易出差错。馏分收集器
13、比较理想，因为便于用微处理机控制，按预先规定好的程序，或按时间，或按色谱峰的起落信号逐一收集和重复多次收集。,数据采集及处理,把检测器的信号转换为色谱图，一般采用色谱积分仪及色谱工作站进行。积分仪较为简单，可以设定积分参数，记录保留时间、峰号以及峰面积，但是分离度和理论板数需手工计算，偏差较大；积分仪可储存少量色谱图，但关机后储存的色谱图即不再保存；积分仪记录介质多为热敏纸，保存时间较长后颜色消退，需另行复印后保存。,目前大部分高效液相色谱仪数据采集多用色谱工作站。较为简单的色谱工作站一般为国内开发，价格较为便宜，但只能进行数据采集，色谱条件只能由仪器设定。相对于积分仪来说，由于使用计算机控制
14、，色谱图比较一目了然，改变积分参数后，可清晰看出色谱图的变化；可以进行分离度、理论板数等简单计算。,第三节 检测方法,紫外检测法,紫外检测法是高效液相色谱中最常用的检测方法。由于有机化合物中近百分之八十都具有紫外吸收，因此紫外检测器的应用最早也最广。这种检测器具有很高的灵敏度，对环境温度及流速波动不甚敏感，适用于梯度洗脱操作。但是紫外检测器一次只能得到一个波长的色谱图，而二极管阵列检测器可以采集三维图谱，针对每一个色谱峰可以进行光谱扫描，进行峰纯度测定。,电化学检测法,高效液相色谱中的电化学检测法，是利用电化学固有的灵敏度对洗脱液中痕量电活性物质进行定性定量分析，既具有宽的线性动力学测定范围(
15、106)及高的灵敏度(10-12g)，可与荧光检测法相比，又可用于色谱行为相似而电化学性质不同的化合物的测定，更具有专属性。因此，在药物分析中，高效液相色谱电化学检测法，主要应用于复杂样品中痕量组分的选择测定，以及较复杂生物样品中药物及其代谢物的测定。,第五节 色谱仪常见故障的分析和排除方法,在高效液相色谱的应用中，故障主要出现在压力异常、漏液、保留时间漂移、基线漂移及噪声、峰形异常等几个方面。故障的起因是多方面的，在仪器的每一环节都有可能出现化学或者机械上的问题。而准确地分析故障的原因所在和及时地排除故障，除专业维修人员外，对实验者来说也是应当了解的。下面就以上五个方面的故障进行分析，简单的
16、故障可自己动手排除。,压力异常,（一）无压力 表现为无压力，流动相不流动。电源问题柱塞杆折断泵头内有空气或流动相不足单向阀损坏漏液压力传感器损坏（流动相流动正常，但无压力）。,（二）压力持续偏高或不断上升流速设定过高保护柱或色谱柱筛板堵塞流动相使用不当或有缓冲盐析出色谱柱选择不当进样阀损坏线路过滤器堵塞,（三）压力持续偏低流速设定过低色谱柱选择不当柱温过高系统漏液,（四）压力波动泵头中有气泡单向阀损坏柱塞密封圈损坏脱气不充分系统漏液使用了梯度洗脱,漏液,（一）接头处漏液接头处松动接头磨损接头被污染部件不匹配,（二）泵漏液单向阀松动泵密封损坏泻液阀损坏接头松动,（三）进样阀漏液转子密封损坏定量环
17、堵塞进样口密封松动进样针尺寸不合适废液管产生虹吸废液管堵塞,（四）检测器漏液流通池垫片损坏 流通池透镜破碎手紧接头处漏液废液管堵塞流通池堵塞,保留时间漂移,柱温变化流动相组分变化色谱柱没有平衡流速变化泵中有气泡流动相选择不当,基线问题,（一）基线漂移温度波动流动相不均匀流通池被污染或有气泡流通池窗口破裂流动相配比不当或流速变化柱子平衡（约3060min）流动相污染，变质或由低品质溶剂配成 检测器没有设定在最大吸收波长处,（二）基线噪声（规则）系统内有气泡有漏液流动相混和不均匀温度影响（检测器和柱温差别太大）,（三）基线噪声（不规则）流动相污染、变质或由低质溶剂配成有漏液流动相各溶剂不相溶或混和不均匀流通池污染检测池能量不足系统内有气泡,峰形异常,（一）前沿峰、拖尾峰柱塞板堵塞色谱柱塌陷柱超载柱温过低,（二）峰展宽进样体积过大流动相黏度过高保留时间过长柱外体积过大样品过载,
