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1、园 艺 学 报 2014，41（6）：10531062 http: / www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao 收稿日期：20131225；修回日期：20140530 基金项目：山东省现代农业产业技术体系项目（SDAIT-03-022-03）；教育部长江学者和创新团队发展计划创新团队项目（IRT1155） * 通信作者 Author for correspondence（E-mail：haoyujin；Tel：0538-8246692） 苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定 马齐军，胡大刚
2、，由春香，郝玉金* （山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，农业部黄淮地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，山东泰安 271018） 摘 要：利用生物信息学的方法，对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测，并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析，同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR，检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫（包括盐、低温、ABA、干旱）的响应，结果表明，MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外，通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能，MdCBL1过量表达
3、明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。 关键词：苹果；MdCBLs家族基因；非生物胁迫；表达分析；MdCBL1；愈伤组织 中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）06-1053-10 Classification and Expression Analysis of Apple MdCBL Family Genes with a Functional Characterization of MdCBL1 MA Qi-jun，HU Da-gang，YOU Chun-xiang，and HAO Yu-jin* （State Key Laboratory
4、of Crop Biology，MOA Key Laboratory of Horticultural Crop Biology（Huanghuai Region）and Germplasm Innovation，College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian，Shandong 271018，China） Abstract：In this study，the functional domains of apple MdCBL family proteins were p
5、redicted with bioinformatics methods. Their phylogenetic relationship with 10 Arabidopsis AtCBL proteins were analyzed. They were systematically named based on the similarity to their Arabidopsis counterparts，respectively. Subsequently，Real-time quantitative RT-PCRs were performed to determine the e
6、xpression levels of apple MdCBLs in different tissues and in response to various abiotic stresses including salt，low temperature，ABA and drought. Results demonstrated that MdCBLs may play roles in different tissues and be involved in the response to abiotic stresses in plants. Finally，MdCBL1 was gen
7、etically transformed into apple callus. Salt-tolerance assay indicated that overexpression of MdCBL1 remarkably increased the tolerance of transgenic apple callus to high salinity，further supporting that MdCBLs genes participate in the response of plants to abiotic stress. Key words：apple；MdCBLs gen
8、es；abiotic stress；expression analysis；MdCBL1；callus 1054 园 艺 学 报 41卷 植物时常处于各种生物胁迫和非生物胁迫中，比如光、植物激素、病原菌等（Zhang et al.，2008）。各种逆境胁迫都能作用于植物细胞，作用的后果是首先引起细胞内钙离子浓度的改变（即钙信号），钙目前被认为是最普遍的第二信使（Sanders et al.，2008）。钙参与植物的很多生命活动，比如保卫细胞气孔的开闭、花粉管的生长、根毛伸长等（Evans et al.，2001；Sanders et al.，2002）。 植物通过不同的钙感应器来应对不同的外界
9、刺激。钙感应器大体可以分成三类：第一类是钙调素（CaM）和类钙调素蛋白（CaM-Like），第二类是钙依赖性蛋白激酶（CDPK），第三类是类磷酸酶蛋白（CBL）（Gu et al.，2008）。 本研究中主要针对第三类CBLs钙感应器。CBL家族基因可以和钙调素一样，被认为是一类钙感应器。CBL基因最初在拟南芥中被克隆出来，同酵母中钙调磷酸酶B和动物中的神经钙调传感器非常相似，因此被命名为类钙调磷酸酶B（Zhu et al.，1998）。后来在很多高等植物，如玉米、水稻、豌豆、大豆和大麦中也发现有CBL基因（Martine et al.，2007；Wang et al.，2007）。 在拟南芥
10、中，AtCBLs家族包含10个基因。CBLs蛋白含有EF手型结构域，可以结合钙离子和特异的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CIPKs）形成复合物，从而调节下游基因，响应外界环境刺激。目前研究表明CBL4和CIPK24可以形成复合物，从而影响CIPK24活性，调节植物对盐逆境的响应。CBL4-CIPK24复合物能够激活下游的SOS1 Na+/H+转运活性，从而把进入细胞内的钠盐排出细胞，使植物适应盐胁迫伤害（Liu et al.，2000）。研究表明，CBL10也可以与CIPK24形成复合物来响应盐逆境信号（Quan et al.，2007）。还有其他CBL和CIPK之间形成复合物，可以响应其他一系列的
11、外界环境刺激（Luan et al.，2002；Gao et al.，2008）。在拟南芥中，SOS信号途径是植物响应盐胁迫的重要途径，已经研究的很清楚（Ahajan et al.，2008）。AtCBL1是AtCBL蛋白家族成员之一，能被低钾、干旱、盐等诱导促进一系列逆境基因的表达，抵制外来胁迫（Pandey et al.，2008）。研究发现AtCBL1和AtCIPK24互作调控植物钠离子的吸收，提高植物盐抗性（Li et al.，2009）。 对于CBLs来说，在模式植物拟南芥中的研究较多，关于木本植物苹果等果树中CBL的研究很少。研究CBLs在苹果中的作用有助于砧木改良和遗传育种，为提
12、高苹果树对非生物胁迫的抗性提供理论基础。本研究中利用生物信息学分析，表达分析及苹果愈伤组织遗传转化等方法，对CBLs家族基因进行相关的分析，为进一步研究它们在苹果逆境响应中的功能奠定理论基础。 1 材料与方法 1.1 苹果CBL家族基因的确定及生物信息学的分析 从拟南芥基因组数据库（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载已注册的10个AtCBLs基因，根据AtCBLs的氨基酸序列，从苹果基因网（http：/genomics.research.iasma.it/）中检索并下载对应的苹果MdCBLs的核酸和蛋白序列。 利用MEGA4.0软件对拟南芥AtCBLs蛋白和预测的苹
13、果MdCBLs蛋白进行序列同源性和进化树分析，并将其命名，分析MdCBLs家族基因的功能域（http：/smart.embl-heidelberg.de/；http：/npsa- pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat）。 1.2 总RNA的提取和qRT-PCR分析 嘎啦苹果不同组织取自于山东农业大学组培室中的组培苗，果实取自南校区苹果树。2013年3月，分别用100 mmol L-1 NaCl、低温（4 ）、ABA、干旱处理组培苗，取样液氮冷冻备用。然后采用RNAplant plus Reagent试剂盒（天根公司）提取RNA，利用反转录试剂盒PrimeScrip
14、t RT 6期 马齐军等：苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定 1055 reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa）获得用于qRT-PCR的cDNA。 通过对苹果基因组中MdCBLs家族基因序列分析，设计定量引物（表1）。qRT-PCR采用SYBR Green荧光试剂发光原理，具体方法参照Hu等（2012）的操作完成。 表1 特异引物 Table 1 Specific primers 基因Gene 上游引物（53）Forward primer 下游引物（53）Reverse primer MdCBL1 ATCAAGCAGGAAGGTGGTGAT
15、A CGTCGCTACAACCCTGTCTAAT MdCBL2 GTGTGATTGGTTAGGGAAATGA CCGAGAGCAGAGACGAATAAAT MdCBL3 GATGGATGGTGGAAAATCTGA AGAGGCTGCTCCCAAGTCT MdCBL4 GCACGCCGAGTTATTTTATGA ACCAAAGTGTAAGGGCACAA MdCBL5 TTACTGGCAATGAAGTGTGTG CAAAACAACGGATGGCTAAGA MdCBL6 CCCCAATCCAAAACAAACAT CAACGGTCCACGAACACTAA MdCBL7 TGAGCCCCACGGATTC
16、TA TCCCATTCTTCCTCTCTGTCA MdCBL8 CCCCAATCCAAAACAAACAT CAACGGTCCACGAACACTAA MdCBL9 CAGCCGTCCGATTTACCTATT GATTCAGAGATGCAACGAACTG MdCBL10 CCCACCTCCTCCTCCTACTAAC GATTCAGAGATGCAACGAACTG 1.3 植物表达载体构建 参照Wang等（2012）的方法提取组培苗总RNA，反转录获得cDNA，以其为模板进行PCR扩增。设计MdCBL1的引物（表2），进行MdCBL1的扩增，获得MdCBL1的ORF序列，用于遗传转化。10个MdCBl
17、s家族基因从嘎啦苹果中扩增。 1.4 农杆菌介导的苹果愈伤组织遗传转化 采用王林苹果的愈伤组织进行遗传转化，固体培养基为MS + 1.0 mg L-1 6-BA + 1.0 mg L-1 2,4-D + 30 g L-1蔗糖 + 7 g L-1琼脂（pH 5.8），每2周继代1次，继代2 3次后取约2 g愈伤组织移入100 mL悬浮培养基（不含琼脂，其它成分与固体培养基相同），为提高细胞的增殖能力，在（25 1）和黑暗条件下振荡培养（110 r min-1）。继代周期为2周，连续培养2 3代后获得生长均可的悬浮细胞系，用于遗传转化。 苹果愈伤组织的遗传转化参照Hu等（2012）的方法进行。取继
18、代10 d左右处于指数生长期的悬浮培养愈伤组织进行农杆菌侵染，浸泡10 min后除去农杆菌菌液，将愈伤组织转移至固体继代培养基上，暗培养2 d后，用无菌水清洗3 5次，清除表面的农杆菌后将愈伤组织转移至含300 mg L-1头孢霉素、30 mg L-1卡那霉素的筛选培养基上进行筛选，继代筛选3 5次后获得稳定生长的抗性愈伤组织，从中提取DNA，用于PCR鉴定。 1.5 愈伤组织鲜质量和相对电导率的测定 愈伤组织鲜质量：用电子天平称取愈伤组织在盐处理20 d后的质量。 植物抗逆性指标相对电导率的测定：将愈伤组织用自来水洗净后再用蒸馏水冲洗3次，用滤纸吸干表面水分，快速称取鲜样3份，每份0.1 g
19、，分别置于10 mL去离子水的刻度试管中，盖上玻璃塞于室温下浸泡12 h，用相对电导仪（Mettler Toledo Inlab 738）测定浸提液电导率（R1），然后沸水浴加热30 min，冷却至室温后摇匀，再次测定浸提液电导率（R2）。相对电导率（%）= R1/R2 100。 1056 园 艺 学 报 41卷 2 结果与分析 2.1 苹果CBL家族基因序列比对与功能域分析 从NCBI（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/）下载拟南芥中的10个AtCBLs，以其序列搜索苹果基因组数据库，发现苹果基因组中有13个同源的MdCBLs基因。功能域分析发现，其中10个MdCBLs蛋
20、白均含有4个保守的螺旋环螺旋EF手形结构域（Lewit & Pety，2000），该结构域含有12个氨基酸；这10个MdCBL蛋白均含有激活域（图1）。而另外3个，MDP0000188435、MDP0000295085和MDP0000464276编码蛋白中没有EF结构域，因此这3个基因并不是MdCBLs家族基因。 将10个MdCBLs家族蛋白与AtCBLs家族蛋白进行亲缘关系分析。系统进化树（图2）表明，10个MdCBLs家族基因与AtCBLs家族基因同源关系很近。根据它们的亲缘关系对每个MdCBLs家族基因进行了系统的命名。这10个MdCBLs家族基因从嘎啦苹果中扩增，发现4个MdCBLs编
21、码的蛋白与基因组数据库预测的序列有差异，MdCBL1、MdCBL4、MdCBL6和MdCBL8分别比对应的预测蛋白短了280、137、191和191个氨基酸（表2）。 图1 苹果MdCBLs功能域分析 Fig. 1 Schematic diagram of the structures for MdCBLs conserved function domains 表2 扩增引物及氨基酸数 Table 2 PCR primers and amino acid numbers of MdCBLs genes and proteins 氨基酸数/aa Amino acid number 基因 Gene
22、 上游引物 Forward primer 下游引物 Reverse primer PCR 基因组预测 Predict 拟南芥同源蛋白 Homologus MdCBL1 GCTGCCAGTTACAAGATTTGCG CAACATACCGATTTCATTCCCT 434 714 213 MdCBL2 CAGGTATGGAGTGTTTTGATCTG GCAATTGTTTATTTCGCCATGAC 250 250 226 MdCBL3 GATGGTGGAAAATCTGAGGGAC CAGACTACATATACACGTACCTT 284 284 223 MdCBL4 CGGCTATCTAGTACATGA
23、GGGG TTAAGCACCTCACTCCCAAACC 297 434 256 MdCBL5 CTTAGCCATCCGTTGTTTTGTC TCGCAACTTCATCTTAAACTCG 257 257 223 MdCBL6 CGACTACAAACATAAGGTCCTC CATTCTTCAGAAACGTGCAACC 226 417 227 MdCBL7 TCTGGGATATTGTTGTAGGAAG GTCGCGCTATGATTGGCTTCTG 353 353 223 MdCBL8 CGACTACAAACATAAGGTCCTC CTACTAGGCCCTTTTACACAAGT 226 417 227
24、 MdCBL9 TGGTGTTGTTAGGTAGATGCTC AACCCGACTTMCCCAAGCAAG 214 214 213 MdCBL10 AGCTGAACTTTGGTGTTGTTAG CCGATTTCATTCCGTTTCCTTT 214 214 213 6期 马齐军等：苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定 1057 图2 苹果和拟南芥CBL家族基因的遗传进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of apple and Arabidopsis CBL proteins 2.2 MdCBL在嘎啦苹果不同组织中的表达情况 MdCBL1、3 10在根中有很高
25、水平的表达，在茎中也有较高表达，但在其他的组织表达水平相对较低；MdCBL2在果实和叶片中表达水平较高，高于根和茎中的表达（图3）。 图3 实时定量RT-PCR检测MdCBLs在嘎啦苹果不同组织中的表达 Fig. 3 Expression analysis of MdCBLs genes in different apple tissues with Real-time quantitative RT-PCR 1058 园 艺 学 报 41卷 2.3 MdCBL对非生物胁迫的响应 以嘎啦植株经过盐、干旱、ABA、低温处理的cDNA为模板，用各个基因的特异引物进行了荧光定量RT-PCR分析。在盐
26、胁迫处理下，MdCBL2、MdCBL4、MdCBL6、MdCBL7、MdCBL9和MdCBL10处理没有响应，而MdCBL1、MdCBL3、MdCBL5和MdCBL8的表达均受盐胁迫诱导，但它们的响应模式有差异：MdCBL1的表达水平在6 h以内没有变化，12 h时表达升高，MdCBL3和MdCBL8的表达水平随着时间延长而逐渐升高，而MdCBL5先下降再升高（图4）。 图4 实时定量RT-PCR检测MdCBLs表达对盐胁迫的响应 Fig. 4 Expression analysis of MdCBLs genes in response to high salinity with Real-
27、time quantitative RT-PCR 与对盐胁迫的影响相似，10个MdCBLs基因对低温胁迫的响应也有所不同，MdCBL4和MdCBL9表达水平随着处理时间延长逐渐升高，处理12 h表达水平为对照的4倍（图5）；其他MdCBLs的表达对低温胁迫响应不明显。在ABA处理下，只有MdCBL7的表达水平受到ABA处理的诱导，表达量是对照的2倍多，其他MdCBLs的表达水平没有明显变化（图6）。在干旱处理下，只有MdCBL4在12 h表达量明显升高，达到对照的2倍左右（图7）。 2.4 鉴定MdCBL1过量表达苹果愈伤组织在盐胁迫中的功能 构建MdCBL1的正义（MdCBL1-TT）和反义
28、愈伤组织（MdCBL1-RT）。用半定量方法检测转基因愈伤组织，证明MdCBL1确实转入愈伤组织中（图8）。WL、MdCBL1-TT和MdCBL1-RT在MS平板上长势基本一致，生长较好，但随着盐浓度增加，长势越来越差。200 mmol L-1 NaCl处理时，MdCBL1-TT愈伤组织长势比野生型和MdCBL1-RT愈伤组织好（图9），说明过量表达MdCBL1能够提高苹果愈伤组织对盐胁迫的抵抗能力。 6期 马齐军等：苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定 1059 图5 实时定量RT-PCR检测MdCBLs表达对低温胁迫的响应 Fig. 5 Expression analys
29、is of MdCBLs genes in response to cold stress with Real-time quantitative RT-PCR 图6 实时定量RT-PCR检测MdCBLs表达对ABA处理的响应 Fig. 6 Expression analysis of MdCBLs genes in response to ABA treatment with Real-time quantitative RT-PCR 1060 园 艺 学 报 41卷 图7 实时定量RT-PCR检测MdCBLs基因表达对干旱的响应 Fig. 7 Expression analysis of
30、MdCBLs genes in response to drought with real-time quantitative RT-PCR 图8 半定量RT-PCR分析野生型、MdCBL1过量表达、MdCBL1反义表达愈伤组织 Fig. 8 Semi-quantitative RT-PCR analysis of MdCBL1 expression in wild type（WL），overexpression transgenic line （MdCBL1-TT）and suppression transgenic line（MdCBL1-RT） 图9 WL、MdCBL1-TT和MdCBL
31、1-RT愈伤组织在NaCl处理下的生长20 d后的状态 Fig. 9 Growth status of 20-day-old WL，MdCBL1-TT and MdCBL1-RT calluses under NaCl stress 6期 马齐军等：苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定 1061 在MS板上三者愈伤组织鲜质量相差不大（图10）。在MS板加上200 mmol L-1的NaCl之后，愈伤组织生长受到影响，但是MdCBL1正义愈伤组织比反义愈伤组织、野生型愈伤组织的长势好；MdCBL1正义愈伤组织相对电导率要低于其他二者，而MdCBL1反义愈伤组织电导率与野生型愈伤
32、组织相差不大（图10）。 图10 盐胁迫条件下WL、MdCBL1-TT和MdCBL1-RT愈伤组织的鲜质量和相对电导率 Fig. 10 Fresh weight and relative electronic conductivity of three kinds of calluses under NaCl stress 3 讨论 目前对拟南芥中CBLs家族基因的研究已经很清楚，这个家族包括10个CBLs，并且在不同的胁迫响应中各有分工，但是在木本植物上的研究却相对较少。CBLs家族基因在胁迫过程中有很重要的作用（Zhao et al.，2009）。AtCBLs可以通过与下游的CIPKs（B
33、atistic & Kudla，2009）相互作用，从而调节CIPKs活性将信号向下游传递（Kolukisaoglu et al.，2004）。在木本植物苹果中，MdCBLs家族基因是否也起这样的作用？研究发现苹果中的CBLs家族基因在序列上存在不同，表明它们可能在不同的胁迫途径中扮演不同的角色。这些结果为进一步研究苹果CBLs家族基因的功能奠定了一定的基础。同时也发现MdCBLs家族基因和AtCBLs基因功能域相似，具有很高的序列同源性。说明MdCBLs家族基因可能具有拟南芥AtCBLs基因家族类似的功能。 对MdCBLs家族基因在不同组织中的表达分析发现，MdCBLs家族基因有的在根中表达
34、高，有的在果实中有很高的表达，说明MdCBLs在不同的组织中负责的功能各异：有的MdCBLs可能在根中参与营养物质的吸收、运输及离子平衡等，有的MdCBLs可能在调控果实品质中有着重要的功能。 以前研究发现AtCBL1对干旱胁迫、盐胁迫和冷胁迫相当敏感，并且影响了另外一些胁迫基因的表达。氨基酸序列比对发现苹果MdCBL1和拟南芥AtCBL1有很高的序列同源性，AtCBL1对盐和干旱都有响应，在冷胁迫下，AtCBL1扮演着负调控角色。Atcbl1突变体可以提高对冷胁迫的适应能力（Zhang et al.，2008）。在拟南芥中，发现Atcbl1和Atcbl9突变体对干旱胁迫比较敏感，从而对干旱的
35、抵抗力下降（Pandey et al.，2008）。而苹果MdCBL1只在盐胁迫中有响应，对干旱和冷胁迫不能响应，可能是苹果MdCBL1和拟南芥AtCBL1基因个别碱基的差异导致不同功能的差异所致。 研究表明CBLs家族基因可以响应多种胁迫，尤其是盐胁迫（Martine et al.，2007）。在以前的研究中，CBLs可以响应非生物胁迫。在盐胁迫下，AtCBL4可以和AtCIPK24相互结合形成复合物，来调控下游基因SOS1的表达，将Na离子排出细胞（Guo et al.，2002）。同时根据以前研究结果AtCBL1和AtCBL10也可能和AtCIPK24形成复合物，来响应盐逆境（Gong
36、et al.，2002）。因此本研究中选择了MdCBLs家族中的MdCBL1进行了抗盐胁迫性分析，结果发现过量表达MdCBL1能够提高转基因苹果愈伤组织的抗盐性（图7）。但在相对电导率测定结果中，发现抑制表达的MdCBL1苹果愈伤组织与野生型苹果愈伤组织在盐胁迫条件下的相对电导率相差不大，推测原因可能是MdCBLs家族基因存在一定的功能冗余来调控盐信号途径。综上，认为MdCBLs家族基因能够参与多种生物与非1062 园 艺 学 报 41卷 生物胁迫过程。这为进一步研究MdCBLs基因的功能奠定了基础，并且为苹果砧木遗传改良提供了理论依据。 References Ahajan S，Pandey
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