湖北省羊口疮病毒的分离鉴定.doc

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1、动 物 医 学 进 展 ，（）： 湖北省羊口疮病毒的分离鉴定王 光 祥 ，尚 佑 军 ，陈 江 涛 ，吕 占 禄 ，张 克 山 ，刘 湘 涛 （中国农业科学院兰州兽医研究 所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室 ，甘 肃 兰 州 ）摘要 ：利 用 传 代 细 胞 系 对 湖 北 通 山 县 某 羊 场 疑 似 羊 口 疮（）的 黑 山 羊 病 料 进 行 分 离 ，通 过 病毒 理 化 特 性 试 验 、动 物 回 归 试 验 和 等 方 法 对 分 离 的 毒 株 进 行 鉴 定 。结 果 表 明 ，病 料 悬 液 接 种 细胞 后 出 现 细 胞 病 变 ，接

2、 种 病 料 的 羊 只 出 现 典 型 的 症 状 ，扩 增 出 羊 口 疮 病 毒 （） 基 因 ，该 毒 株 与 台 湾 山 羊 株（、）相 似 性 最 高 （均 为 ），亲 缘 关 系 最 近 。 本 研 究 成 功 分 离 鉴 定 到 一 株 ，命 名 为 。关 键 词 ：羊 传 口 疮 病 毒 ；分 离 鉴 定 ；动 物 回 归 试 验 ；聚 合 酶 链 反 应中 图 分 类 号 ：文 献 标 识 码 ：文 章 编 号 ：（）羊 口 疮（）亦 称 羊 传 染 性 脓 疱 、羊 传 染 性 脓 疱皮 炎 、羊 传 染 性 脓 疱 口 炎 ，是 由 羊 口 疮 病 毒 （）引 起 的

3、一 种 人 兽 共 患 接 触 性 传 染 病 。 本 病 最 早 于 年 发 现 于 欧 洲 ，现已广泛分布于 全 世界 ，以澳 大 利 亚 、新 西 兰 等 国 最 为 严 重 。 我 国 吉 林 、甘 肃 、内 蒙 古 、陕 西 、西 藏 、四 川 、云 南 等 主要养羊省区均有 本 病 发 生 的 报 道 。本 病 的 病 原 为 痘病毒科副痘病毒 属 成 员 ，可 在 牛 和 山 羊 的 胚 肾 细 胞 、犊牛和羔羊的睾 丸 细 胞 培 养 中 生 长。 近 年 来 ，随 着 养 羊 业 的 发 展 ，羊 只 引 种 等 交 易 频 繁 ，加 速 了 该病在我国各省的 发 生 ，给

4、养 羊 业 带 来 巨 大 的 经 济 损 失 。 年 月 中 旬 ，湖 北 省 通 山 县 某 羊 场 有 多 只 月 月 龄 黑 山 羊 羔 羊 发 病 ，发 病 率 达 ， 主 要 表 现 为 典 型 的 口 疮 症 状 ，经 多 种 抗 生 素 和 驱 虫 药 治 疗 无 效 ， 周 后 有 多 只 病 羊 死 亡 。 为 了 查 明 病 因 并 获 得 致 病 毒 株 ，本 试 验 对 病 毒 进 行 了 系 统 的 分 离 鉴 定 ，现 将 结 果 报 告 如 下 。量 标 准 、 提 取 试 剂 盒 、胶回收 试剂盒均为宝生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 产 品 ； 高

5、 糖 培 养 基 、胎 牛 血 清 为 公 司 产 品 ；其 他 试 剂 均 为 国 产分 析 纯 试 剂 。方 法病 料 处 理取痂皮病料用 无 菌 生 理 盐 水 漂洗 次 后 剪 碎 、研磨并以无菌 生 理 盐 水 按 （）制 成 悬 液 ，加 青 霉 素 、链 霉 素 各 单 位，置 冻 融 次 后 浸 毒 过 夜 ，以离心，取上清液经菌检阴性后置 备用。挑选长成致密 单 层 且 形 态 完 好病 毒 分 离的 细 胞 ，用 提 前 预 热 至 的 液 清洗 细 胞 次 次 ，接 种 处 理 好 的 病 毒 液 ， 感 作 ，加 入 维 持 液 继 续 培 养 并 逐 日 观 察 细

6、胞 生 长情况和细胞病变 ，同 时设 正 常 细 胞 对 照 。 当 细 胞 出 现 细 胞 病 变 时 收 毒 ，冻 融 次 后 继 续 传 代 。若 细胞在接种病料后 内 未 出 现 病 变 则 连 续 盲 传 代 ，若 第 代 仍 未病 变 视 为 阴 性 。材 料 与 方 法材 料病 毒 理 化 学 特 性 试 验取 代 细 胞 病 毒细 胞 株 、病 料 细 胞株由本实验室 液 ，用 （碘脱 氧 尿 苷 ）处理病毒液进行病 毒 核 酸 类 型 鉴 定 ；用 乙 醚 和 氯 仿 处 理病毒液进行脂 溶 剂敏感试验 ； 水 浴 进 行 病 毒 耐 热 性 试 验 。 分 别 用 细 胞

7、在 孔 板 上 测 定 病 毒 的 ，未 处 理 的 正 常 细 胞 设为 对 照 。保 存 ，病 料 采 自 湖 北 省 通 山 县某 羊场发病山羊疑似 羊 口 疮 唇 部 痂 皮 。昆 明 乳 鼠 、 月龄兔子由本所动 实 验 动 物物 场 提 供 ， 月 龄 黑 山 羊 羔 羊 购 自 甘 肃 省 某 羊 场 。 聚 合 酶 、 分 子 质试 剂收 稿 日 期 ：基 金 项 目 ：国 家 现 代 肉 羊 产 业 技 术 体 系 项 目 （）作 者 简 介 ：王 光 祥 （ ），男 ，甘 肃 武 威 人 ，助 理 研 究 员 ，主 要 从 事 动 物 病 毒 病 研 究 。 通 讯 作 者

8、动 物 接 种 试 验将 处 理 并 保 存 的 痂 皮以 提 取 的 病 毒 基 因 组 为 模 板 ，采 用 的 反 应 体 系 （ （ ）； ； （ ）；毒 液 分别接种以下动物： 乳 鼠 ：皮 下 注 射 日龄 昆 明 乳 鼠 ， 只 ，各 接 种 只 ，另 设 注 射 同 剂 量 生 理 盐 水 的 只 乳 鼠 作 对 照 。 家 兔 ：背 部 及股 内 侧 皮 肤 经 剪 毛 消 毒 后 划 痕 接 种 、腹 部 作 皮 内 注射 待 检 上 清 液 ， 只 ，各 只 ，另设注射同剂量 生 理 盐 水 的 只 家 兔 作 为 对 照 。 羊 ：选 只 月 龄 黑 山 羊 羔 羊 ，

9、将 病 料 悬 液 划 痕 接 种 口 唇 黏 膜 ，背 部 及 股 内 侧 皮 内 注 射 待 检 上 清 液 ，共 处 ，每 处 接 种 ，另 设 注 射 同 剂 量 生 理 盐 水 的 只 羔 羊 作 为 对 照 。上 下 游 引 物 、 各 ； 模 板 ；），扩 增 目 的 片 段 。 反 应 条 件 为 ； ， ， ，个 循 环 ； 。 取 产 物 在 琼脂糖凝胶上电泳 ，检 测 扩 增 结 果 。 回 收 产 物 送 宝 生 物 工 程 （大 连）有 限 公 司 测 序 。 将 测 序 结 果 进行 比 对 分 析 ，同 时 应 用 软 件 的 软 件 对 分 离 株 基 因 的

10、测 序 结 果 进 行 生物信息学分析 。分 离 毒 株 的 测 定在 孔 细 胞 培养 板 内 培 养 单 层 细 胞 ，将 传 代 细 胞 毒 代 代 细 胞 毒 分 别 用 常 规 方 法 测 定 ，最 后 用 法 计 算 。结 果病 毒 分 离 及 传 代 结 果病 料 悬 液 接 种 细 胞 后 从 第 一 代 细 胞 出 测 序 及 序 列 分 析根 据 中现 细 胞 病 变 ，病变时间出现在 左 右 ，继 续 传 到 代 细 胞 病 变 时 间 更 加 规 律 ，细 胞 病 变 时 间 出 现 在 基 因 序 列 （登 录 号 ： ，），用 和 软件设计扩增引物 ：以 后 ，细

11、胞 病 变 表 现 为 ：胞 核 浓 缩 、变 圆 、团 聚 、拉 网 、最 后 脱 落 的 现 象 （图 和 图 ）。 对 照 细 胞 正常 ，收毒时间都维持在 以 内 。 继 续 传 代 至 代 细 胞 病 变 规 律 ，且 随 着 传 代次数 的增加出现细胞 病 变 也 更 加 规 律 ，将该病毒分离株命名为 。； ：。 引 物 由 上 海 生工生 物工 程技术服 务有限公司合成 。 分 离 毒 鉴 定用 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有限 公 司 提 取 试 剂 盒 ，按 说 明 书 从 病 料 痂 皮 和传 代 细 胞 病 毒 液 中 （第 代 至 第 代 ）提 取 。图 对 照

12、细 胞 理 化 学 鉴 定 结 果将 第 代 细 胞 毒 经 、 乙 醚 、图 细胞产生细胞病变 为丘疹和小结节 ，继 而 成 为 水 疮 。 在 接 种 后 第 天 唇 部 出 现 脓 泡 ，而 后 形 成 疣 状 硬 痂 （图 ）。 氯 仿 、 水 浴 处 理 后 ，测 定 的 分别 为 、 ，与 未 经 处 理的相应病毒液 的 （）相 比 ，经 处 理 的 病 毒 液 的 均 有 不 同 程 度 的 降 低 。分 离 株 各 代 次 传 代 细 胞 毒 测 定 结 果分 离 株 随 传 代 次 数 的 增 加 ，病 毒 在 细 胞 中的感染滴度 逐 步升 高 ，但 传 代 至 代 后 病

13、 毒 滴 度 增 加 缓 慢 ，趋 于 稳 定 （表 ）。 检测结果及序列分析 以 分 离 株 第 代 至 第 代和原病料痂皮分 别 提 取 的 病 毒 基 因 组 为 模 板 进 行 扩 增 ，扩 增出 左 右 的 目 的 基 因 片 段 ，与 预 期 的 片 段 长度 相 符 （图 ）。 将 该 片 段 回 收 并 测 序 ，测 序 结 果 经动 物 接 种 试 验接 种 乳 鼠 ，观 察 周 ，与对照相比均未产生明显 的 临 床 症 状 ；接 种 家 兔 后 ，在 接 种部位未出现水 泡 和 脓 疱 ，只 出 现 丘 疹 状 红 斑 ；接种病料的羊只在接 种 后 第 ，在 划 线 接 种

14、 部 位 出 现 红 斑 ，红 斑 逐 渐 变王 光 祥 等 ：湖北省羊口疮病毒的分离鉴定 核 酸 序 列 搜 索 后 与 测 序 结 果相似性较高的 个 病 毒 核 酸 序 列 均 为 核 酸 序 列 。 相 似 性最高的序列为 台 湾株 （、），相 似 性 均 为 。图 接种山羊发生严重羊口疮 分 离 株 在 细 胞 上 的 测 定 结 果表 病 毒 代 次变 良 好 。病 毒 理 化 学 特 性 试 验 结 果 表 明 ，碘脱氧 尿 苷 （ ）对 病 毒 有 明 显 的 抑 制 作 用 ，病 毒对 脂 溶 剂 敏 感 、不 耐 酸 碱 、对温度有一定的抵抗力 、反 复冻融毒价下降 ，表明

15、该病毒核酸属 型 。 产物测序结果分析 表 明 ，我 们 检 测 到 了 特 异 性的 基 因 ，结合动物回归试 验 结 果 证 明 所分离到的细胞 毒 株为 痘 病 毒 科副痘病毒属的羊 口 疮病 毒 。回归试验结 果表 明 细 胞 适应毒能引起羔羊 出 现 典 型 的 羊 口 疮 症 状 ，与临床见到的病例吻合 。 本 研 究中临床发病 均 为 哺 乳 期 羔 羊 或 断 奶 羔 羊 ，未 见 成 年 羊 。用 该 分 离 毒 接 种 乳 鼠 未 见 临 床 病 变 ，这 与 国 内 报 道 的 相 符。 同 时 用 该分离毒接种 家 兔 ，在 接 种部位只出现 丘 疹状 红 斑 ，未出现

16、水泡和脓疱 ，这 可 能 是 由 于 该 分 离 毒 毒 力 较 弱 所 致 。 另 外 ，本 试 验 用 细 胞 分 离 的 毒 株 ，在 经 细 胞 传 代 时 ，前 代痂 皮 中 基 因 产 物 ； 代 到 代 细 胞 毒 中 基因 ；阴 性 对 照 ； 标 准 ； ； 图 痂皮及细胞毒中 基 因 扩 增 结 果 将 该 分 离 株 基 因全序列 测序结果与国内 外 发 表 的 毒 株 相 应 序 列 进 行 比 较 ，应 用 软 件 包 中 软 件 的 方 法 计 算 遗 传 距 离 ，根据遗传距离 绘制核苷酸系统 发 育 进 化 树 （图 ）。 基 因 进 化 树 结 果 表 明 ，

17、与 山 羊 分 离 株 （）（）的 亲 缘 关 系 较 近 。同 时 ，与 分离株同处于一 个进化分支上的 毒 株 均 来 源 于 山 羊 ，另一大的分支 上的毒株均来源 于 绵 羊 。病 毒 滴 度 增 加 较 快 ，但 代后病毒滴度增加较慢 ， 代 代 毒 病 毒 滴 度 在 左 右 ，趋 于 稳 定 ，病毒 滴 度 不 高 。而 分离 羊 口 疮 病毒一般常用的细 胞 是牛 、羊 睾 丸 原 代 细 胞 ，分 离 的 病 毒 病 毒 滴 度 可 达 到 以 上。 造成 病毒滴 度不高的原因是由 于 所 选用的细胞系 不 同 ，还 是 由 于 毒 株 的 原 因 有 待 于 通 过毒株对比

18、试 验 和在 分 子 水 平对其毒力基因进 行 分 析等进一步证实 。该 分 离 株 与 其 他 国 内 外 参 考 毒 株 基 因 相应部分核苷酸 序 列相 似 性 比 较结果表明 ，不 同 来 源 、讨 论病 原 分离鉴定是诊断 羊 口疱病 的金 标 准 ，本 试 验 用 细 胞 从 自 然 发 病 山 羊 羔 羊 的 痂 皮 病 料 中 分 离 出 株 病 毒 ，传 代 至 代 ，病毒传代细胞病 不 同 分 离 株 的 基 因 高 度 保 守 。 因 此 ， 基 因可以作为羊口 疮 病 毒 分 子 诊 断 靶 基 因 ，同 时 也 可 将该基因表达产 物 应用 于 血 清 学诊断 。图

19、分 离 株 基因的进化树分析 目 前 ，世 界 各 国 特 别 是 养 羊 业 发 达 的 国 家 ，已 用分 子 生 物 学 的 方 法进行疾病诊断 ，并加紧进行病毒 分 子 生 物 学 研 究 和 基 因 工 程 苗 的 研 究 工 作。 我们 利 用 细 胞 对 羊 口 疮 病 毒 进 行 了 分 离 鉴 定 ，成 功 分 离 到 一 株 羊 口 疮 病 毒 ，为 今 后进一步研制羊 口 疮 疫 苗 和 检 测 试剂打下了良 好 的基础 ，进 而 为 该 病 的 防 控 提 供 了 技 术 保 障 。参 考 文 献 ： 赵 立 志 ，薛 双 虎 ，吕 武 夫 ，等 羊 传染性脓疱皮炎病毒的细胞培 养 中 国 兽 医 杂 志 ，（）： ， ， ， （）： ， ， ，（）： ， ，： ， ，（）： 殷震 ，刘 景 华 动 物 病 毒 学 版 北 京 ：科 学 出 版 社 ，： ， ，： 秦云 羊 传 染 性 脓 疤 研 究 进 展 中国畜禽传染病 ，（）： 何 水 林 ，陈 杰 ，蔡 玉 书 ，等 羊 口 疮 病 毒 的 分 离 鉴 定 中 国 兽 医 科 技 ，（）： 罗云 ，申 之 义 羊 传 染 性 脓疱病毒分离及生物学特性研究 中 国 动 物 检 疫 ，（）： ， ， ， （， ， ， ，）： （）（，），：；