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1、瓜类细菌性果斑病研究进展阎莎莎王铁霖赵廷昌中国农业科学院植物保护研究所北京100193基金项目公益性行业农业科研专项201003066国家西甜瓜产业技术体系CARS36通讯作者Emailtingchangzhaogmailcom收稿日期20110124AdvancesinthebacterialfruitblotchofmelonscausedbyAcidovoraxcitrulliYanShashaWangTielinZhaoTingchangInstituteofPlantProtectionChineseAcademyofAgriculturalSciencesBeijing100193
2、Chi-naAbstractBacterialfruitblotchofmelonsatypicalseedbornediseasecausesseriousdamagesontheplantsofcucurbitsmelonandwatermelonforinstanceworldwideTheagentofbacterialfruitblotchofmelonsisAci-dovoraxcitrulliInthispaperthecurrentsituationofthebacterialfruitblotchofmelonswasreviewedincludingtheadvancesi
3、nthedetectionpathogenicmechanismgeneticdiversityandpreventionofAcidovoraxcitrulliKeywordsAcidovoraxcitrullidetectionpathogenicmechanismgeneticdiversityprevention摘要瓜类细菌性果斑病是发生在甜瓜、西瓜等葫芦科植物上的一种严重的世界性病害此病是典型的种传细菌性病害病原为嗜酸菌属西瓜种Acidovoraxcitrulli。本文围绕瓜类细菌性果斑病菌的分离检测、致病机理、遗传多样性及防治等方面的研究进展作一概述阐明了瓜类细菌性果斑病的研究现状
4、。关键词瓜类细菌性果斑病菌检测致病机理遗传多样性防治中图分类号S4130瓜类细菌性果斑病是葫芦科植物上的一种严重的世界性病害其病原为嗜酸菌属西瓜种Aci-dovoraxcitrulli1。病原菌的命名经历了从类产碱假单胞菌西瓜亚种Pseudomonaspseudoalcaligenessubspcitrulli2到嗜酸菌属燕麦种西瓜亚种Aci-dovoraavenaesubspcitrulli3再到嗜酸菌属西瓜种Acidovoraxcitrulli的过程。瓜类细菌性果斑病菌可以侵染多种葫芦科作物如西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜等自报道以来已在美国、澳大利亚、巴西、土耳其、日本、泰国、以色列、伊朗、匈牙
5、利、希腊和我国多个省份发生给当地的西甜瓜种植业造成了严重的损失。瓜类细菌性果斑病菌菌体短杆状革兰氏染色阴性不产生荧光严格好氧单根极生鞭毛。能在41下生长不能在4下生长。在KB培养基上呈现乳白色、圆形、光滑、全缘、隆起、不透明菌落菌落直径12mm。该菌引起烟草过敏反应结果不一致不产生精氨酸水解酶明胶液化力弱氧化酶和2酮葡糖酸试验阳性24。果斑病菌在种子中的存活时间长抗逆能力强主要存活于种皮下的胚乳表层5。分别保存了34a和40a的西瓜种子和甜瓜种子种植发芽后用ELISA检测瓜类细菌性果斑病菌结果为阳性可见果斑病菌抗干旱和衰老的能力非常强6。1检测瓜类细菌性果斑病菌是我国进境植物检疫性有害生物因此
6、快速准确地检测果斑病菌是有效防治果斑病的前提。主要检测方法如下11血清学检测方法将血清学技术用于疾病的诊断和控制已有接近百年的历史由于血清学方法灵敏快速、使用方便目前已广泛用于植物病原细菌的检测其缺点是检测精度低、容易出现假阳性。目前报道的用于检测瓜类细菌性果斑病菌的血清学方法主要有酶联免疫吸附测定EnzymeLinkedImmunosorbentAs-sayELISA、直接琼脂双扩散DirectDoubleDiffu-sionDDD、免疫凝聚试纸条检测法、滤膜免疫染色法membranefiltrationimmunostaining等。ELISA法应用最普遍检测果斑病菌灵敏度为105cfu/
7、mL但是容易出现假阳性不能区分与果斑病菌同属的172011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3其他3个亚种7。Walcott等采用单克隆抗体免疫磁珠吸附与ELISA相结合的技术检测瓜类细菌性果斑病菌使灵敏度大大提高8。熊亮斌等建立改良DASDotELISA法检测瓜类细菌性果斑病菌以硝酸纤维素膜为载体对DotELISA法的封闭条件、包被抗体浓度、点样量等条件进行优化检测灵敏度为19105cfu/mL。为快速检测西瓜果斑病菌提供了一种新途径9。DDD法为在平板培养基上离菌落一定距离处打适当大小的孔加血清继续培养至沉淀线出现。该方法可以直接在分离平板上鉴定菌落快速、省时检测
8、果斑病菌灵敏度可达107cfu/mL10。利用专化型免疫凝聚试纸条检测果斑病菌时对照线会在35min内出现同时对照线和检测线会由红色变成紫色检测线颜色深浅与被检测的病菌浓度呈正比。免疫凝聚试纸条检测灵敏度为106cfu/mL具有简便、快速、易操作特点适用于田间快速检测和病害诊断11。Matsuura等利用改良的滤膜免疫染色法membranefiltrationimmunostaining检测果斑病菌在1000粒商品种子配成的100mL的PBS缓冲液中可以检测到其中的几粒种子12。该方法可以与选择性培养基筛选相结合为检测果斑病菌提供了新思路。12基于PCR的检测方法PCR方法已成为分子生物学领域
9、的经典试验方法此法灵敏、准确、快速近年来发展迅速并衍生出许多新技术如免疫学和PCR结合、实时荧光定量PCR等。目前基于PCR的检测方法已广泛用于瓜类细菌性果斑病菌的检测。121常规PCR常规PCR的快速检测引物尤其重要。用于果斑病菌检测的PCR引物主要有Walcott等根据16SrDNA序列设计的WFB1/WFB2但是该引物不能将果斑病菌与同属的其他3个亚种区分开7Walcott等根据16S23SrRNA的ITS区InternalTranscribedSpacer序列设计的SEQID4m/SEQID5该引物扩增时嗜酸菌属的其他3个亚种都为阴性13回文广等利用ITS序列设计了特异性引物对果斑病菌
10、进行检测检测灵敏度为3105cfu/mL7Bahar等人报道了一对引物BXL1/BXSR2可检测出5000粒种子中002携带有果斑病菌的种子14田艳丽等根据hrpB2基因序列设计特异性引物HB2F2/HB2R2检测瓜类细菌性果斑病菌灵敏度为103cfu/mL15上述引物序列及反应条件见表1。表1用于检测果斑病菌的PCR引物和反应条件引物名称序列反应条件WFB15GACCAGCCACACTGGGAC3955min9530s65WFB25CTGCCGTACTCCAGCGAT330s7230s30cycles725minSEQID4m5GTCATTACTGAATTTCAACA3955min9530s
11、53SEQID55CCTCCACCAACCAATACGCT330s7230s35cycles725minBXL15CAGCTGGGAGCGATCTTCAT3951min9435s68135sBXSR25GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA37245s35cycles727minHB2F25CCTCCAGCTGCCCGTATC3953min9430s6030sHB2R25CGGACACCCGGTACATCAGC37230s30cycles725min122免疫PCRImmunoPCR免疫PCR技术是1992年由SanoT等最早使用的。该技术将血清学中抗原抗体反应的特异性与PCR的强特异扩增
12、能力结合起来可以在短时间内精确地检测病原物的存在。Song等利用免疫富集PCR法immunoconcentrationPCR和直接PCR法检测果斑病菌对于纯化的菌落悬浮液直接PCR和免疫富集PCR检测灵敏度都能达到3104cfu/mL对于未纯化的种子悬浮液直接PCR的检测灵敏度为3105cfu/mL免疫富集PCR仍然达到3104cfu/mL。可见免疫富集PCR更灵敏、方便已用于进出口种子的检测16。123免疫磁性分离PCRImmunomagneticSepa-rationandPolymeraseChainReactionIMSPCR免疫磁性分离是基于磁性免疫微球immu-nomagnetic
13、microsphereIMMS和PCR的检测方法IMSPCR检测灵敏度高可达到10cfu/mL且可以消除种子碎片等杂质的影响Walcott等研究表明IMSPCR在侵染率为001时仍可以检测到果斑病菌而ELISA和PCR在侵染率小于10时就检测不到果斑病菌了8。124基于实时荧光定量PCRRealtimeQuan-titativePCR的检测方法实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到272011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3定量的飞跃优点是自动化程度高、灵敏快速、操作简便、可做多重PCR缺点是仪器昂贵。冯建军等利用TagMan探针实时荧光PCR检测瓜类细菌性果
14、斑病菌灵敏度达103104cfu/mL17。回文广等将生物学、免疫学和分子生物学方法有机结合起来即将选择性培养基富集、IMSPCR、实时荧光定量PCR技术结合起来建立了瓜类果斑病菌快速检测的方法可检测到每千粒种子中的一粒带菌种子7。Ha等将磁珠捕获法和多通道实时荧光PCR法相结合用瓜类果斑病菌和瓜类蔓枯病菌的混合物为模板灵敏度分别为10cfu/mL和105conidia/mL与实时荧光PCR相比灵敏度提高了10倍。可检测到5000粒种子中002的带病种子18。Zhao等用选择性培养基EBB和EBBA对果斑病菌进行培养后分别用直接realtimePCR和realtimeBIOPCR检测果斑病菌可
15、检测到1000粒种子中的1粒病种子。该方法灵敏度高可排除杂菌的影响具有较好的应用前景19。13其他检测方法目前报道的用于果斑病菌检测的其他试验方法主要有环介导基因恒温扩增loopmediatediso-thermalamplificationLAMP和利用特异性单克隆抗体的表面等离子共振成像技术。Oya等利用过滤膜membranefiltration和环介导基因恒温扩增法检测果斑病菌根据hrpG基因到hrpX基因的区间序列设计引物检测灵敏度与实时荧光定量PCR相当20Puttharugsa等将单克隆抗体用于表面等离子共振成像技术surfaceplasmonresonanceima-gingSP
16、Rimaging检测瓜类细菌性果斑病菌检测灵敏度为106cfu/mL低于ELISA但其具有表面可再生、支持多通道检测等优点可用于自然条件下侵染的样品的检测对果斑病菌选择性强21。2致病机理和遗传多样性21致病机理对于瓜类细菌性果斑病致病机理的研究主要包括型和型分泌系统的研究、群体感应系统的研究、鞭毛的研究等。211型和型分泌系统的研究型分泌系统T2SS和型分泌系统T3SS在植物病原细菌侵染寄主的过程中有重要作用T3SS促使毒性蛋白直接进入植物细胞T2SS促使降解蛋白分泌到植物细胞间质中。Johnson等证实果斑病菌T3SS的结构基因hrcC的缺失突变体致病性减弱、不能引起过敏性坏死反应但是仍然
17、可以在种子中定殖T2SS的前菌毛素肽酶pulO基因的突变体在种子中的定殖能力明显降低发芽幼苗的发病率从野生型的915降低至11。研究表明T3SS对果斑病菌的致病性有重要作用与定殖无关T2SS影响病菌的定殖和种子到幼苗的传播22。国内的任争光等利用转座子MiniTn5构建了果斑病菌某菌株的突变体库筛选到1株致病性明显减弱的突变体突变基因为果斑病菌T3SS的保守基因hrcR突变体不能引起烟草过敏反应互补菌株的致病力恢复到野生型的8423。这也说明T3SS是瓜类果斑病菌致病性的重要因子。212群体感应系统细菌的群体感应系统quorumsensingQS能产生并释放信号分子且能被生物群体感应从而在细菌
18、侵染过程中起到调控菌体浓度的作用已经证实果斑病菌中存在群体感应系统2425。Johnson等利用果斑病菌Aac001的luxI和luxR突变体验证QS在病菌定殖和种子到幼苗的传播中的作用。当接种浓度为106cfu/mL时突变体和野生型都能定殖和传播当接种浓度为103cfu/mL时luxI突变体在种子到幼苗的传播中明显降低26。结果证明QS在果斑病菌从种子到幼苗的传播中有重要作用。革兰氏阴性菌中的信号分子一般是酰基高丝氨酸环内酯类物质acylhomoserinelactoneAHL陈涛等在瓜类果斑病菌的全基因中发现了信号分子的合成基因acluxaclux缺失突变株完全丧失了合成AHLs的能力同时
19、其在西瓜果实和幼苗上的致病性也显著降低但不影响其生长能力27。可见群体感应调节系统在瓜类果斑病菌的致病过程中扮演着十分重要的角色可以通过干扰信号分子以扰乱群体感应系统的调控作用从而破坏果斑病菌的致病性。213鞭毛和菌毛果斑病菌有单根极生鞭毛其鞭毛在侵染过程中有重要的作用IV型菌毛typeIVpiliTFP可帮助病菌定殖和在维管束导管中移动。Bahar等利用微流体室法对野生型和TFP突变体菌株进行了对比实验结果表明IV型菌毛在表面吸附和生物膜形成方面有重要作用帮助菌体定殖和在维管束导管中液体流动状态下扩散。鞭毛蛋白突变体实验表明两极鞭毛并不是表面吸附和生物膜形成所必须的其在导管中液体流动慢或不流
20、动时发挥372011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3作用28。22遗传多样性瓜类细菌性果斑病菌存在丰富的种内遗传多样性为瓜类抗病品种的筛选增加了困难。国外从1991年开始相继有学者开展了对瓜类果斑病菌种内遗传多样性的研究。应用于果斑病菌遗传多样性研究的方法主要有致病性测定、生理生化反应、脉冲场凝胶电泳PFGE、脂肪酸甲酯分析FAME、基因外重复回文序列PCRREPPCR、扩增片段长度多态性AFLP、多位点序列分型MLST等。Walcott等先后利用PFGE、FAME29和PFGE、REPPCR30对来自美国的121株瓜类果斑病菌和来自全球多个国家的64株瓜类细菌性
21、果斑病菌进行了种内遗传多样性的分析2次的实验结果相同都将所有菌株分成了两个亚群。亚群主要包括分离自甜瓜、南瓜等的果斑病菌亚群主要包括分离自西瓜的果斑病菌。致病性测试显示亚群的菌株对西瓜幼苗的侵染力明显强于亚群的菌株而对甜瓜和南瓜等的侵染力弱于亚群亚群的菌株对各个寄主的侵染力比较平均。Wal-cott等的研究还发现83的亚群菌株对硫酸铜不敏感而田间防治果斑病的主要方法就是使用含铜杀菌剂3132可见这种防治方法对果斑病并不是完全有效且抗铜基因有可能由亚群菌株水平迁移到亚群菌株这也应该引起人们的关注。Wen等用AFLP法研究了瓜类果斑病菌的遗传多样性利用荧光标记的引物和ApaI/TaqI双酶切的方法
22、研究了瓜类果斑病菌的遗传多样性。参试的59株菌株中除了一株以色列菌株其余的58株在相似性为85时分为2组33。冯建军等利用MLST法对来自美国、中国和其他国家的93株瓜类果斑病菌进行了遗传多样性的分析将所有菌株分成两大菌落复合体clonalcom-plexesCC34。61株分离于西瓜的菌株中有38株属于CC223株属于CC129株分离于甜瓜或哈密瓜的菌株中24株属于CC1仅有5株属于CC2。这与Walcott提出的果斑病菌2个致病性亚群基本一致30。MLST具有较高的可重复性和实验室之间的可比性所有数据可以提交网络为果斑病菌今后的研究提供了借鉴。瓜类细菌性果斑病菌起源于国外引入中国以来覆盖区
23、域逐年增大。对于果斑病菌种内遗传多样的研究主要集中在国外冯建军的研究引入了部分中国境内的菌株然而中国还有许多地区有果斑病的发生对应菌株还没有引入研究。阐明中国果斑病菌种内的分子进化关系对抗性资源的筛选、综合防治以及病害流行都有重要的意义。3防治瓜类细菌性果斑病是我国的检疫性病害进口时应杜绝带菌种子进入35。同时注意从无病区引种生产的种子应进行种子带菌率测定36。种子生产方面应使用无病菌的种子进行原种和商业种子生产制种田必须与其他瓜类田自然隔离。发生或怀疑发生病害的田块不能采种相邻地块发病而本身未发病的田块也不能采种。种子处理可以用3盐酸处理瓜种15min水洗后再用47加瑞农600倍液浸种处理过
24、?购蟛?7。农业防治方面必须进行轮作倒茬发生过果斑病的田块至少3年不种植西瓜或其他葫芦科作物。田间灌溉利用滴灌而不用喷灌。病害一旦出现随时清除病株、病果并彻底清除田间杂草。不要在叶片露水未干的病田中工作也不要把病田中用过的工具拿到无病田中使用3637。做好苗床处理使用同一温室多年繁育瓜苗要在当年瓜苗移植之后彻底清理温室内的残留瓜苗和杂草35。无病菌的种子不与未检验的种子在同一育苗室内生产幼苗不同育苗室内的用具不能交换使用36。防治瓜类细菌性果斑病的化学药剂主要有538氢氧化铜干悬浮剂可杀得800倍液、50氯溴异氰尿酸水溶性粉剂消菌灵800倍液、47春王铜可湿性粉剂加瑞农800倍液等。因果斑病菌
25、部分菌株有抗铜性应谨慎使用含铜杀菌剂。田间使用新植霉素有很好的防治效果38。用47加瑞农可湿性粉剂和90新植霉素可溶性粉剂苗期防效均超过8039。生物防治方面目前报道的对果斑病有防治效果的生防菌主要有酵母菌Pichiaanomala40、荧光假单胞菌Pesudomonasfluorescens、工程菌株染色体整合了24二乙酰基间苯三酚41、葫芦科内生细菌中的部分芽孢杆菌Bacillusspp42等。目前使用抗病品种是防治果斑病最根本最有效的措施但是迄今并没有发现对果斑病免疫或高抗的品种。Hopkins等报道三倍体西瓜较二倍体抗病且抗病性强的品种果皮坚硬果皮颜色深感病品种的果皮呈浅绿色43。由于
26、还没有开发出具有472011年第3期植物检疫PLANTQUARANTINEVol25No3商业价值的抗果斑病品种培育抗病品种依然是当前研究的难点。4结束语近年来对瓜类果斑病的研究取得了许多进展但还有许多问题没有解决。1针对该病菌的检测技术始终没有广泛应用到实际生产中还需要开发更实用、简便的田间检测方法。2对瓜类果斑病的防治还是一个没有彻底解决的课题研究该病菌的致病机理、遗传多样性也是深化病害防治的关键由于没有商业化的抗病品种应加速抗病材料的选育速度开展生物技术育种利用生物技术辅助选择甚至转基因手段创造新型的瓜类抗病材料。3对于瓜类抗性机制方面还未进行系统的研究。应加强这方面的研究为抗病品种选育
27、提供依据。参考文献1SchaadNWPostnikovaESechlerAetalReclassificationofsubspeciesofAcidovoraxavenaeasAAvenaeManns1905e-mendAcattleyaePavarino1911combnovAcitrulliSchaadetal1978combnovandproposalofAoryza-espnovSystApplMicrobiol2008314344462SchaadNWSowellGGothRWetalPseudomonasPseudol-caligenessubspcritrullisubspNo
28、vIntJSystBacteriol19782811171253WillemsAGoorMThielemansSetalTransferofseveralphytopathogenicPseudomonasspeciestoAcidovoraxasAcidovoraxavenaesubspavenaesubspnovcombnovAcidovoraxave-naesubspcitruliAcidovoraxavenaesubspcattleyaeandAci-dovoraxkonjaciIntJSystBacteriol1992421071194赵廷昌孙福在王兵万等哈密瓜果斑病病原菌鉴定植物病
29、理学报20013143573645DuttaBGenzlingerLLWalcottRRLocalizationofAci-dovoraxavenaesubspcitrulliAacthebacterialfruitblotchpathogeninnaturallyinfestedwatermelonseedPhytopathology2008986SS496ShepherdLMBlockCCLongtermsurvivalandseedtrans-missionofAcidovoraxavenaesubspcitrulliinmelonandwater-melonseedPhytopatho
30、logy2009996SS1197回文广赵廷昌SchaadNW等哈密瓜细菌性果斑病菌快速检测方法的建立中国农业科学20074011249525018WalcottRRGitaitisRDDetectionofAcidovoraxavenaesub-spcitrulliinwatermelonseedusingimmunomagneticseparationandthepolymerasechainreactionPlantDisease2000844704749熊亮斌刘箐王天昌等改良DASDotELISA检测西瓜细菌性果斑病菌微生物学通报201037101551155610王政胡俊哈密瓜细菌性
31、果斑病种子带菌血清学检测技术的初探内蒙古农业大学学报2005261202411粟寒吴翠萍李彬等免疫检测试纸条法检测西瓜子中的瓜类果斑病菌植物检疫2009231121312MatsuuraTShirakawaTSatoMetalDetectionandisola-tionofAcidovoraxavenaesubspcitrullifromwatermelonCit-rulluslanatusseedsusingmembranefiltrationimmunostainingJapaneseJournalofPhytopathology200874315315613WalcottRRGitaitisRDCastroCRoleofblossomsinwater-melonseedinfestationbyAcidovoraxavenaesubspcitrulliPhy-topathology200393552853414BaharOEfratMHadarEetalNewsubspeciesspecificpolymerasechainreactionbasedassayforthedetectionofAci-dovoraxavenaesubspcitrulliPlantPathology200857754.
