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1、1,2015药典-无菌检查,江苏省医疗器械检验所,2023年2月,1,2,主要内容,无菌产品理念无菌和无菌检查法概念 无菌操作及无菌技术要求无菌检查法的局限性医疗器具无菌检验依据实验环境条件及人员要求试验主要设备培养基种类用途及配制要求培养基适用性检查方法适用性试验供试品的无菌检查,2023年2月,2,1、无菌产品理念,灭菌产品的无菌保证不能依赖最终产品的无菌检验，它是作为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证体系和严格的GMP管理。,2023年2月,3,3,4,无菌：是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。无菌检查法：用于
2、检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。,2、无菌和无菌检查法概念,2023年2月,4,3、无菌操作及无菌技术要求,无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法。无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其他干扰的一系列操作方法和有关措施，无菌试验器材及无菌操作。,2023年2月,5,5,4、无菌检查法的局限性,若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试 品在该检验条件下未发现微生物污染。,2023年2月,6,6,7,5、医疗器具无菌检验依据,本规范选用于中国药
3、典2015年版 四部 1101无菌检查法。GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法，第二部分：生物试验方法中规定的无菌试验方法。,2023年2月,7,8,6、实验环境条件要求,2015药典无菌检查：应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止微生物污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。,2023年2月,8,6.1实验环境
4、洁净度要求（修改）,2023年2月,9,9,10,6.2 实验环境人员要求：,菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。,2023年2月,10,11,7、试验主要设备,细菌培养箱霉菌培养箱超净工作台可调温的培养箱显微镜台式高压蒸汽灭菌器立式高压蒸汽灭菌器电热恒温干燥箱集菌仪,2023年2月,11,12,试验仪器（1）-超净工作台,2023年2月,12,13,试验设备（2）-隔水式恒温培养箱,2023年2月,13,14,试验设备（3）-霉菌培养箱,2023年2月,14,15,试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器,2023年2月,15,16,试验设备（5）-台式蒸汽灭菌器,2023年2月
5、,16,17,试验设备（6）-显 微 镜,2023年2月,17,18,试验设备（7）-生物安全柜,2023年2月,18,19,试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统,2023年2月,19,20,8、培养基种类及用途,硫乙醇酸盐流体基（主要用于厌气菌培养、也可用于需氧菌培养）胰酪大豆胨液体基（用于真菌和需氧菌培养）,2023年2月,20,21,8.1 培养基配制及要求,培养基的灭菌：配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。保存时间：制备好的培养基应保存在：2 25、避光环境。非密闭容器中：一般在三周内使用；密闭容器中：一般可在一年内使用。,2023年2月,21,22,8.2 培养基配制及要
6、求,硫乙醇酸盐培养基：配制后调节PH值为弱碱性，使灭菌后在25 的pH为7.10.2，分装在适宜的容器中，其装量与容器高度的比列应符合培养后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度1/2。灭菌。在供试品接种前，培养基的氧化层（粉红色）的高度不得超过培养基深度的15，否则，须经100水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。硫乙醇酸盐培养基：置3035培养。,2023年2月,22,23,8.3 培养基配制及要求,胰酪大豆胨液体基：取培养基成分混合，微温溶解，滤过，调节PH值约为7.30.2，加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。胰酪大豆胨液体基：置2025培养。,202
7、3年2月,23,24,8.4 培养基配制及要求,培养基装量：对于采用直接接种法检查的供试品，应根据供试品接种量确定培养基的装量，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不大于培养基体积的10%。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。,2023年2月,24,25,9、培养基适用性检查,无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查的要求。无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支（瓶），置培养基规定的温度培养14天，应无菌生长。灵敏度检查：用于培养基灵敏度检查所用的菌株传代不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为0代），采用适宜的方法保
8、存；并以保证试验菌株的生物学特性。,2023年2月,25,26,9.1 培养基适用性检查,菌种：试验用菌株及菌液制备：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003铜绿色假单胞菌CMCC(B)10104 枯草杆菌CMCC(B)63501 生孢梭菌CMCC(B)64941 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003,2023年2月,26,27,2023年2月,注：10倍梯度稀释；选择适宜的3个稀释级别；要求100cfu/ml。,27,28,9.2 培养基适用性检查,菌液制备 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接
9、种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，3035培养18 24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼脂培养基上，2025培养24 48h，上述培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌量小于100cfu菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，2025培养5 7天，加入3 5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（V/V）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu孢子悬液
10、；（如表9.3）注：菌悬液在室温下2h使用,若保存在2 8 可在24小时内使用。,2023年2月,28,29,9.3 培养基灵敏度检查,2023年2月,培养基灵敏度检查使用6株菌见下表,29,30,9.4 培养基适用性检查,培养基接种 金黄色葡萄球菌2支 硫乙醇酸盐流体培养基 铜绿假单胞菌2支 12ml（7支）生孢梭菌2支 空白对照1支 分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌菌悬液各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天，逐日观察结果。,2023年2月,30,31,9.5培养基适用性检查,培养基接种 枯草芽孢杆菌 2支 胰酪大豆胨液体基 白色念株菌 2支 9ml（7支
11、）黑曲霉 2支 空白对照1支 每分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支,另1支不接种作为空白对照,培养5天，逐日观察结果。,2023年2月,31,32,9.6 培养基适用性检查,结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管试验菌生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。,2023年2月,32,33,10.方法适用性试验,试验目的:1)进行无菌检查时，应进行方法适应性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查；2)若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验；3)方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐
12、一进行方法确认。,2023年2月,33,34,10.1 方法适用性试验,菌种及菌液制备：除大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B)4 4102外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。注：大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。,2023年2月,34,10.2 方法适用性试验,35,2023年2月,36,10.3 方法适用性试验,结果判断 与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中试验菌生长微
13、弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用：1)增加冲洗量，或增加培养基的用量；2)使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。注：方法适用性试验也可与供试品的无菌检查同时进行。,36,2023年2月,11、供试品的无菌检查,无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。供试品无菌检查所采用的检查和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。无菌试验过程中，若需试验表面活性剂、中和剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。,37,37,2023年2月,11.1 供试品无菌检查,38,2023年2月,11.2 供试品的无菌检查,阳性对照应根据
14、供试品特性选择阳性对照菌：,39,2023年2月,11.3 供试品的无菌检查,阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照；阴性对照不得有菌生长。,2023年2月,40,40,41,11.4 供试品的无菌检查,薄膜过滤法：薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45m，直径约为50 mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥，为发挥滤膜最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试品经薄
15、膜过滤后，若需要冲洗液冲洗滤膜。每张滤膜每次冲洗量为100ml.,且总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。,2023年2月,41,11.5 供试品的无菌检查,水溶性供试品：取规定量，直接过滤，或混合至含不少 于100ml适宜稀释的无菌容器中，混匀，立即过滤。如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜。冲洗次数不少于三次，所用的冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。除生物制品外，一般样品冲洗后，1份滤器加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，1份滤器加入100ml胰酪大豆胨液体培养基。,例如：,42,2023年2月,11.6供试品的无菌检查,水溶性固体供试品：取规定量，加适宜的稀释液溶
16、解或按标签说明复溶，然后按水溶液供试品项下的方法进行操作。具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品：取规定量，每个小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。,43,2023年2月,11.7 供试品的无菌检查,具有导管的医疗器具（输血、输液袋等）供试品：取规定量，每个小包装用50-100ml冲洗液分别冲洗内壁，收集冲洗液于无菌容器中，然后照水溶液供试品项下方法操作。同时应采用直接接种法进行包装中所配带的针头的无菌检查。,44,2023年2月,45,11.8 供试品无菌检查,直接接种法
17、：适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般样品无菌检查时两种培养基接种的支/瓶数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的支/瓶数为2：1。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。,2023年2月,45,11.9 供试品的无菌检查,例 如：,46,2023年2月,11.10 供试品
18、的无菌检查,培养及观察：将接种的供试品后培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置3035，一份置2025 培养。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。若加入供试品后或培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取培养液适量转种同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判定是否有菌。,47,2023年2月,48,10.11 供试品的无菌检查,结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，否则试验无效。若供试品管均澄清，或显浑浊但经确证无
19、菌生长，判供试品符合规定；若供试品中任何一管显浑浊并确证有菌生长判供试品符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。符合下列任何一个条件，可判试验结果无效：（1）无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。（2）回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。（3）供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。,2023年2月,48,49,11.12 供试品的无菌检查,结果判断：试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。,2023年2月,49,表1 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量,2023年2月,50,注：若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍,50,2023年2月,51,51,注：如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml 以上，将其完全浸没。,52,表3.供试品的最少检验量,52,2023年2月,53,谢谢大家！Thank you,2023年2月,
