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1、细胞工程,原生质体培养和体细胞杂交 2011级8班 唐元嫚,植物原生质体：是去掉细胞壁的裸细胞。保持着植物细胞的全能性，而且仍能进行植物细胞的各种生命活动。是植物细胞工程和许多理论研究的理想材料。Eg:利用原生质体可以进行植物细胞膜的结构与功能，细胞壁的形成与功能，病毒侵染机理，植物激素作用机理等多方面的研究。是植物遗传转化的理想受体，而且为实现远源物种间的体细胞杂交，培育新种开辟了新的途径。,植物细胞的全能性,原生质体的分离与纯化,原生质体的分离原生质体的纯化与活力测定,原生质体的分离,1、材料的选择由于叶肉细胞排列疏松，且叶肉原生质体有叶绿体，取材也方便，因此叶肉是最常用的材料。对于单子叶
2、植物和大多数双子叶植物而言，采用颗粒较小，疏松易碎的胚性愈伤组织及由其建立的胚性悬浮细胞系更容易获得高质量的原生质体，在培养中更容易得到持续的细胞分裂。无菌幼苗的子叶，下胚轴和根等也可用于原生质体的分离。供体的年龄，生理状态和生长环境等都可能影响原生质体的得率、质量以及以后的培养和再生，也影响实验的重复性。Eg:从生长在人工气候箱中的烟草植株的叶片获得的结果比田间材料得到的结果较稳定，并易于重复。,2、材料的预处理,作用：生理状态，增加细胞膜的可能是改变细胞和细胞壁的强度；也可能是改变细胞壁的化学成分或是减轻酶溶液中杂酶对原生质膜的损伤，以提高细胞壁酶解的效率。,方法：（1）暗处理（2）预培养
3、（3）预萎焉（4）预质壁分离,3、分离方法,（1）机械分离法：是早期研究中借助于利器或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。（2）酶分离法：酶分离法是指用不同种类和浓度的酶处理细胞，将细胞的壁解离，以获得原生质体。常用酶的种类：纤维素酶（cellulase);果胶酶（pectinase)；半纤维素酶（hemicellulase);崩溃酶（driselase);蜗牛酶（sanailase)。酶液的配置：一般由不同的酶制品、渗透稳定剂（糖醇、可溶性糖以及无机盐）以及稳定质膜的药品（附加钙盐0.1%）组成，有时也加入少量缓冲剂或其他药品。（3）分离原生质体：a、两步分离法 b、一步分离
4、法,机械法,优点：（1）能排除酶的有害影响；缺点：（1）原生质体的产量低；（2）方法繁琐费力；（3）局限性大,图示：原生质体分离过程（以叶片为例）,过滤、离心,加果胶酶和纤维素酶,原生质体的纯化与活力测定,1、原生质体的纯化将包括处理过的材料在内的酶解混合液经过尼龙网或不锈钢网过滤（网孔视原生质体的大小而异），除去大的残渣，然后收集含原生质体的滤液，再洗涤纯化。方法:（1）沉降法：将滤液低速离心，转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍然悬浮在上清液为准。（2）漂浮法：是根据原生质体、细胞或细胞碎片相对密度不同而设计的，但用这种方法纯化，原生质体得率较低。（3）界面法：是利用高分子聚合物混
5、合液产生两相水溶液的原理，离心可使原生质体处于两液相的界面之间，可获得数量较大的纯净原生质体。,界面法,500mmol/L蔗糖,140mmol/L蔗糖+360mmol/L山梨醇,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。,100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇+原生质体,2、原生质体活力的测定,（1）形态特征形态上完整、含有饱满的细胞质、颜色鲜艳的正常球形原生质体为有活力的原生质体。（2）活体染色用0.1%酚番红或Evans蓝染色后进行观察，有活力而质膜完整的原生质体不着色，而死亡的原生质体能被染上色。（3）其他还可以用氧
6、电极测定呼吸或测定原生质体的光合活性（绿色细胞）等方法来测定其活力。真正确定原生质体的活力还是要看原生质体能否进行持续有丝分裂并再生植株。,原生质体活力检测,形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。,原生质体的活力测定-染色法,原生质体培养,培养基培养方法原生质体的再生培养操作实例：三叶半夏的原生质体培养,培养基,1、无机盐一般认为原生质体培养基中大量元素应比愈伤组织培养基中的浓度低，对其培养效果影响最大的是钙离子浓度和氮源的种类及其浓度。2、渗透稳定剂常用的有葡萄糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖醇和麦芽糖等。糖类是培养基中碳源，也同时是培养基渗透势的调节剂
7、。3、有机成分含有丰富有机物质的培养基有利于细胞分裂，如被广泛应用于原生质体培养的KM8p培养基。4、植物生长物质一般认为，在培养基中加入2,4-D对分化却有抑制作用，因此，在愈伤组织形成后应该及时调整激素的种类和浓度。,培养方法,1、液体培养（1）液体浅层培养 将一定的原生质体悬液在培养皿底铺一薄层，封口后进行培养。（2）微滴培养 微滴的大小很重要2、固体培养-琼脂糖包埋利用低熔点琼脂糖，可在30度左右溶化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。（对混合时的温度要求十分严格）3、液体-固体结合培养（1）双层培养 固体培养和液体浅层培养相结合（2）琼脂糖珠培养 通过调整液体培养基的渗透势来调
8、节培养物的渗透势，以利于其进一步的生长和发育。4、饲喂层培养用洗涤过的经辐射处理过的原生质体作为饲喂层，再将未经辐射的原生质体铺在上面进行培养。,原生质体培养方法,原生质体再生培养,原生质体的再生过程是指原生质体在适当的培养方法和良好条件下，先形成新的细胞壁，然后再生细胞持续分裂形成细胞团，最后或通过愈伤组织或胚状体获得再生植株的过程。1、细胞壁再生 细胞壁的再生能力和速度与供体植物的种类和其体细胞的分化程度及生理状态有关。研究烟草叶肉组织原生质体再生细胞壁主要成分时发现，原生质初生细胞壁的成分与供体不同。2、细胞分裂和愈伤组织或胚状体形成原生质体再生出完整细胞壁后，才能进入细胞分裂阶段，但再
9、生出壁的细胞并不一定都能进行有丝分因此原生质体植板率因其供体植物不同有很大差异。,当那些可持续分裂的细胞形成小的细胞团时，一般应将他们转接至无渗透稳定剂的培养基中，按一般的组织培养方法进行培养。3、植株再生原生质体培养形成的愈伤组织转移到分化培养基中，可以经器官发生或体细胞胚胎发生再生植株。两步成苗法：先将愈伤组织培养在含细胞分裂素（一般0.52.0mg/l)和低浓度2,4-D（一般0.020.2mg/l）的分化培养基上，形成质地较硬的胚性愈伤组织或胚状体，再将其转含细胞分裂素的分化培养基上再生植株。4、操作实例：三叶半夏的原生质体培养,a:first division,10 days aft
10、er protoplast isolationb,c:2 and 3 wo microcolonies.d,e:4 and 6 wo microcallif:8 wo microcalli just before being transferred onto B5 medium,a,b,c,d,e,f,i,h,g,Recovery of plantlets through somatic embryogenesis,g:Transfer of microcalli onto B5 medium and induction of somatic embryos.h:Transfer of glo
11、bular embryos onto B5 medium for maturation of somatic embryos.i:Transfer of cotyledonary stage embryos onto MS medium for conversion of embryo into plantlets.,原生质体的分离、培养与再生过程示意图,体细胞杂交,原生质体的选择原生质体诱导融合的方法杂种细胞的选择与鉴定杂种植株的鉴定体细胞杂种的遗传特征,番茄和马铃薯的,属间体细胞杂种“Potamato”。,去掉细胞壁,原生质体融合,植物体细胞杂交：即植物原生质体融合（protoplast
12、fusion)，是将不同亲本的植物原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。可以达到利用远源基因改良植性状的目的。1、原生质体的选择应采取既容易融合，又利于杂种筛选，还能形成稳定遗传重组体，并能再生植物的原生质体亲本组合，才能期望获得较好的实验结果。需考虑以下几个方面：（1）获得的原生质体要多，活力要强，遗传上要一致；（2）选择培养再生植物较易的材料作为融合亲本；（3）选择亲本应带有可供融合后识别异核体的性状，如颜色、核型及染色体差异等；（4）在异核体发育中有能选择杂种的标记性状，如营养突变体或对某药物敏感等；（5）若以育种为目的，两亲本的亲缘关系不宜过远；（6）
13、根据需要可以选择含有部分遗传信息或部分染色体的一个亲本的亚原生质体和另一个亲本的正常原生质体融合。,2、原生质体诱导融合的方法,2.1无机盐诱导融合最早被用作融合剂的无机盐是硝酸钠溶液。硝酸钠的作用是综合质膜表面的负电荷，使原生质膜紧密接触，从而促进细胞融合。该法融合频率低，尤其是当用于高度液泡化的叶肉原生质体时更是这样。2.2聚乙二醇诱导融合Keller等（1973）建立了高钙-高PH法。Kao（高国楠）和 Michayluk（1974）发现聚乙二醇（PEG）是很好的融合剂，建立了聚乙二醇法，并在后来和高钙-高pH法结合使用，使大豆和豌豆的原生质体融合率最多高达50%。此法无种属特异性，可以
14、进行各种植物之间无亲缘关系的物种间的原生质体融合，甚至是动物细胞之间的融合。,PEG(聚乙二醇)处理,融合基本过程,2.3 电诱导融合技术该技术对原生质体没有毒害作用，融合率高，重复性好，操作简便，同时融合的条件便于控制。电融合不适合大小相差较大的原生质体融合，且设备昂贵。基本过程：第一步、在交变电场作用下，使原生质体彼此靠近，紧密接触，在两个电极间排列成串珠状。第二步、施以强度足够的直流电脉冲，使质膜发生可逆性电击穿，从而导致紧密接触的细胞融合在一起。,两个电极间串珠状原生质体,(聚乙二醇)处理,3、杂种细胞的选择与鉴定,原生质体融合是非特异性的，可能会产生多种融合状态，包括来自亲本原生质体
15、融合形成的异核体(heterokaryon),同一亲本原生质体融合形成的同核体（homokaryon）以及未发生融合的双亲本原生质体，还有多核体。所以需要借助一些特殊的方法，把融合产物中的异核体筛选出来。方法有：3.1互补选择法利用两个亲本具有不同的遗传和生理等特征，在特定培养条件下，只有能产生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。此方法要求亲本有某些遗传缺失、营养缺陷或对药物的不同抗性等前提条件。（1）营养缺陷型互补选择（2）抗性互补选择（3）白化互补选择（4）代谢互补选择,3.2机械选择法,机械选择是利用两种亲本原生质体的某些可见标志，如形态色泽上的差异等，在倒置显微镜下，用微吸管将融合细
16、胞吸取出来，在带有小格的Cuprak培养皿中进行培养和选择的方法。Eg:Kao等（1977）将来自大豆根尖悬浮培养细胞的具有浓厚细胞质的非绿色原生质体与粉蓝烟草叶肉细胞的绿色、液泡化的原生质体进行融合，异核体从形态上很容易与亲本区别。用微吸管将异核体吸取出来，转移到Cupark培养皿中进行培养，待异核体长成细胞团后再做进一步的鉴定。对于形态上无法区分的原生质体融合杂种细胞，可以用两种不同的荧光素分别标记亲本原生质体的方法进行选择，如用异硫氰酸荧光素（fiuorescein isothio-cyanat，发绿色荧光）和碱性蕊香红荧光素(rodamine isothiocyanate,发红色荧光)
17、等,4、杂种植株的鉴定,对筛选出来的杂种细胞或植株必须从多方面进行鉴定，以确定它们是否是真正的细胞杂种。（1）形态学观察 观察比较杂种植株是否会具有其双亲的形态学特点。如花的形态、大小和颜色，叶片的形态等。（2）细胞学观察 根据染色体的形态、数目和大小判定。（3）同工酶分析 通过凝胶电泳来比较、分析双方亲本和融合细胞的某些同工酶谱。可用来进行同工酶分析的有酯酶，苹果酸脱氢酶、乙酸脱氢酶、过氧化物酶等。（4）分子生物学检测采用核基因组DNA的RAPD（随机扩增多态DNA）和AFLP（扩增片段长度多样性）分析，细胞器DNA的Southern杂交分析,5、体细胞杂种的遗传特征,在多数情况下，异核体在
18、第一次有丝分裂时即发生两个亲本核的融合，也有在有丝分裂前就发生融合的。但融合的结果并不一定就是我们所需要的双而倍体，而是有很多变化的。能否产生双二倍体好像和两亲本亲缘关系的远近无明显关系，甚至能进行有性杂交的亲本形成的体细胞杂种染色体数目也可能有差异（deviation）。体细胞杂种培养过程中染色体丢失时常见的现象。一般两亲本的亲缘关系越远，染色体丢失越严重，有时一个亲本的染色体全部丢失。在有性杂交中，胞质基因仅来自母本，而在体细胞杂交中，杂种细胞可获得来自双方亲本的胞质基因。因此，体细胞杂交也可能获得胞质杂种（cybrids）,思考题,1、分离、纯化和培养植物原生质体的主要方法有哪些？并简述它们的优缺点。,2、简述PEG法和点诱导融合法的技术过程。3、简述体细胞杂种的选择和鉴定方法。4、体细胞杂交有何意义？,
