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1、,糖化血红蛋白的测定方法及其在临床中的应用价值,1、糖化血红蛋白的定义,糖化血红蛋白（GHb）是红细胞在生存期间HbA与己糖（主要是葡萄糖）缓慢、持续且不可逆地进行非酶促反应的产物。由于HbA所结合的成分不同，又分为HbA1a（与磷酰葡萄糖结合）、HbA1b（与果糖结合）、HbA1c（与葡萄糖结合），其中HbA1c含量最高，占60%-80%，是目前临床最常检测的部分。,糖化血红蛋白的测定结果以百分率表示，指的是和葡萄糖结合的血红蛋白（HbA1c）占全部血红蛋白的比例。非糖尿病患者的糖化血红蛋白的水平为4%-6%。,正常成人体内的血红蛋白,成人 Hb,胎儿 Hb,未糖化,糖化,-主要的糖化血红蛋
2、白,80%,HbA1c由蛋白的非酶法糖化形成,葡萄糖进入红细胞后与HBA的链N端缬氨酸残基缩合,再经Amadori 分子重排后,2、糖化血红蛋白的特性,（1）糖化血红蛋白比例高低的决定因素,取决于血糖的浓度 血糖与血红蛋白的接触时间 红细胞的存活时间 血糖浓度越高，接触时间越长，HbA1c的比例越大,（2）反应近2-3个月的平均血糖水平,人体内红细胞的寿命一般为120天，在红细胞死亡前，血液中糖化血红蛋白含量也会保持相对不变。因此糖化血红蛋白水平反映的是在检测前2-3个月内的平均血糖水平。稳定性好。糖化血红蛋白是逐渐生成的，且不易分解，短期内的血糖升高或降低，不会引起糖化血红蛋白的波动，能更好
3、地反映较长时间的血糖控制程度。,（3）可以随机抽血进行检测，简便易行，可重复性好。,HbA1c的测定方法,通常分为两大类：一类是基于GHb和Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法。另一类是基于Hb上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、免疫法和酶法等。,电泳法 与离子交换层析法一样也是基于糖化和非糖化的Hb所带的电荷不同进行分离。此法精密度高，但分析时间较长。亲和层析法 基于糖化和非糖化Hb结构不同进行分析的。除外HbA1c外，血液中的其他糖化的Hb也可与亲和物结合，因此该方法的检测结果为GHb总量，而不是HbA1C含量免疫法 可在全自动生化分析仪上用免疫抑制比浊法测定HbAlc水平。具有良好的
4、精密度和抗干扰能力。,酶法 原理是在蛋白酶的作用下，切断HbAlc 的链N末端的糖化二肽，糖化二肽在果糖基肽氧化酶的作用下生成过氧化氢，在过氧化氢酶的作用下与显色剂产生显色反应，通过测定吸光度求出定HbAlc 的百分数。床旁检验或快速检验（POCT）有2种方法，一种是利用硼酸亲和原理在颜色反射计上进行检测。HbAlc特异性地与硼酸复合物结合呈蓝色，而未糖化Hb呈红色，通过两者光强度的比例计算。另一种是基于免疫反应原理在荧光分析仪上检测含HbAlc 的荧光染料分子的斑点数，换算成HbAlc 的数值。此方法便携、快速，但精密度较其他方法要差。,离子交换色谱法 葡萄糖与血红蛋白链N端缬氨结合后等电点
5、降低，导致糖化的Hb所带的正电荷比未糖化的Hb少，与树脂的附着力小，可分别用不同离子强度的缓冲液在不同时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据峰值下面积来计算HbAlc占总Hb的比例。目前临床上较常采用高效液相色谱法（HPLC）和低压液相色谱（LPLC），HPLC被国际上列为测定HbAlc 的参考方法。,干扰因素,1.Hb的变异体对HbAlc 测定的影响 常见的变异体有HbF即Hb的链由链替代：如地中海贫血、镰状细胞病患者。还如HbS、HbC、HbE等。Hb的变异体会随着HbAlc 一起洗脱而影响HbAlc的测定值。,2.Hb的化学修饰产物 最常见的是氨基甲酰化Hb(肾病患者)和乙酰化Hb(
6、接受阿司匹林治疗者)。氨甲酰化为高浓度尿素在体内形成异氰酸,结合到Hb N末端氨基酸上，形成氨基甲酰血红蛋白。其与HbAlc的等电点相似，使得HbAlc 测定结果假性升高。有关报道，此法测定HbAlc时，如果尿素浓度超过17mmol/L，每升高1mmol/L会使测定值升高0.04%。另外肾病患者常伴有贫血,红细胞寿命缩短,在解释检测结果时，要综合考虑。,3.红细胞生存期的改变 当患有溶血、失血性贫血等时，红细胞代谢加快，HbAlc值通常下降。缺铁性贫血时，衰老的红细胞所占的比例增高，HbAlc值会假性增高。,全自动糖化血红蛋白测定装置ADAMSTMA1c HA-8160,HA-8160的技术参
7、数,测定对象：全血测定项目：HbA1c、HbA1、HbF及图样测定原理：逆相分离阳离子交换层析柱样本使用量：约 4uL（全血样本）样本容器：采血管（EDTA，NaF、肝素）必须样本量：采血管 1mL,HA-8160的特点,HPLC法：高速分离稳定性HbA1c，特异性强、精密度高。自动去除不稳定性HbA1c同时测定HbA1、HbF能发现变异Hb，修饰Hb高速测定：90秒/样本HbA1c的测定范围在320%之间。,HA-8160波形,HbA1a1,HbA1a2,HbA1b,C,HbF,HbA0,HbA1c,HA-8160结果样图,测定信息,测定结果,波峰信息,色谱图,影响测定结果的标本因素,测定前
8、标本的储存 室温（15-25）下保存2周，冰箱（2-8）保存1个月，测定结果的变异率均低于3%，稳定性良好。HbA1c通常用翻倒混合的血或者自然沉降血球。如用和血糖测定共用NaF抗凝采血管，也可用离心分离的血球。但要在700g(1500rpm)、5min左右温和的离心条件下做前处理，否则HbA1c的测定值有若干偏高的情况出现。,对于非重度溶血标本，可进行测定。HPLC分析图中可出现变性峰形。存在未检出结果的情况 贫血患者当Hb浓度太低时65g左右，低于最低检出量，可采取低速离心后适当弃去部分血浆调节Hb浓度至正常水平。,HbA1c的临床应用,主要有三方面,糖尿病的诊断监测糖尿病患者长期血糖的控
9、制状况 HbA1C的监测目的在于消除血糖波动对病情控制的影响。是国际公认的糖尿病监控“金标准”。糖尿病并发症的风险评估 其水平高低与糖尿病并发症的风险密切相关,一 糖尿病诊断,DM的诊断标准：DM(1)具有糖尿病的症状，FPG7.0mmol/L（2）具有糖尿病的症状，随机血糖11.1mmol/L，且伴有尿糖阳性者。(3)OGTT峰值11.1mmol/L，OGTT2hPG11.1mmol/LIFG FPG 6.1-6.9mmol/L，2hPG7.8mmol/L。IGT FPG7.0mmol/L，2hPG7.8-11.1mmol/L 临床症状不典型者，需要另1d重复检测确诊，但不主张做第3次OGT
10、T。,（一）HbA1c用于糖尿病的诊断,随着HbA1c检测标准化的逐步完善，2010年美国DM协会（ADA）更新DM诊疗指南，将其和FPG、OGTT一起列为DM诊断标准之一。并指出 HbA1C 6.5作为诊断DM的标准，HbA1C在5.7-6.4%为DM前期，5.7-6.0%为DM高危期，6.1-6.5%为DM超高危期。,ADA的诊断标准是否适用于中国人，此标准颁布后，不少文献报告以OGTT为金标准评价HbA1C诊断糖调节受损（IGR）和DM的诊断效能。北京大学第一附属医院徐国宾教授在他的 HbA1C对糖调节受损和2型糖尿病的诊断价值文章中指出，推荐6.5%作为诊断DM的cut off 值或医
11、学决定水平是合理的，其具有较高的特异性和阳性预测值，一般96%，生理变动较FPG低，但敏感性不如FPG，HbA1C 6.5%不能排除经血糖检测和OGTT试验确诊的DM患者。因此，与血糖联合检测有助于提高糖尿病诊断的敏感性和特异性。另外，在他的此项研究中不支持HbA1C在5.7-6.4%为IGR的诊断标准。,（二）HbA1C在妊娠期糖尿病中的诊断,妊娠期糖尿病（GDM）是指在妊娠期发生或首次发现的不同程度的高血糖症，包括妊娠前已经存在但漏诊的孕前DM及孕期伴随发生的糖耐量异常。GDM发病率逐年呈上升趋势，孕期随着血糖水平的升高，妊高症、剖宫产率、巨大儿、胎儿畸形、早产以及子代患糖尿病、心血管疾病
12、的风险也会增加。GDM对母婴近期和远期都会造成很多不良影响。,美国糖尿病学会（ADA）2011年制定了新的GDM诊断标准，孕24-28周用75g葡萄糖进行口服葡萄糖耐量试（OGTT），以空腹、糖后1h 2h血糖5.1、10.0、8.5mmol/L作为cut off 值，3项中任何1项值达到或超过上述标准即可诊断GDM。但此项检测过程需要多次采血，操作繁琐，给孕妇带来痛苦和不便。HbA1C 是否可以作为GDM一个辅助诊断指标，使用普通人群的 HbA1C cut off 值诊断GDM是否合理有待进一步探讨。,我国有文献报道，HbA1C诊断GDM的最佳cut off值4.9%，他的特异性和敏感性均高
13、于80%，诸多研究显示，孕期 HbA1C 升高的水平与孕期母婴健康关系密切。但HbA1C 并未被推荐作为GDM的诊断指标之一。这还需进行更广泛的临床验证。（妊娠期由于红细胞周转加快，红细胞寿命缩短，空腹血糖降低，使得糖化时间缩短，导致妊娠期HbA1C生理性下降）。,（三）与应激性高血糖的鉴别诊断,各种应激反应如手术、创伤，感染、急性心肌梗死、脑血管意外等疾病和输注了含葡萄糖注射液后，都可以使血糖升高，但这种高血糖的 HbAlc 不一定升高，若为糖尿病患者HbAlc则升高，对两者签别诊断和指导治疗很有价值，,二 监测糖尿病患者长期血糖的控制状况,对于血糖控制状态较为平稳的患者，每年至少应接受2次
14、HbA1c的检测。对于血糖控制状态不稳定的、需要改变治疗方案及正在进行胰岛素治疗的患者，应该每3个月检测1次。,(三)评估糖尿病慢性并发症的发生与发展,HbAlc是监测糖尿病患者血糖控制情况的金标准,是评估糖尿病并发症风险的有效指标.糖尿病足病、糖尿病性周围神经炎、眼病、肾病、心脏病以及脑血管病变等是DM最常见的慢性并发症。也是导致DM死亡的主要原因。DM的早期诊断、生活方式的干预、治疗、监控对于延缓并发症的发生具有重要意义。,8%,9%,心力衰竭的几率,Hb,死亡的几率,心肌梗死的几率,中风的几率,微血管病变的几率,白内障摘除手术的几率,糖化血红蛋白检测的标准化,实验室中由于不同的测定原理方法所得到的测定值存在较大差异，为了解决检测结果的可比性和溯源性问题，国际上GHb测定的标准化工作已进行了多年，美国（NGSP美国糖化血红蛋白标准化计划）、日本（JDS日本糖尿病学会）、瑞典（SFKK瑞典临床化学学会）等国家分别建立了HbA1c的国家标准计划。并且在参考方法、标准物质、检测与治疗界值、测定方法及数据转换公式上达成共识。我国在GHb测定一致性和标准化工作方面也作出了不少努力并取得了一定成绩。,IFCC-NGSP换算公式 NGSP（%）=0.09148*IFCC（mmol/mol）+2.152,谢谢,
