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1、第二章 DNA复制(DNA Replication),第一节 基本概念,第二节 复制概况,第三节 DNA复制的酶学,第四节 DNA复制的半不连续性,第五节 DNA复制,第六节 DNA损伤修复,第五节 DNA的复制(DNA replication in Prokaryote),DNA复制结构的研究,利用突变表型来考察基因的功能,但只能利用条件型突变温度敏感突变体,材料:E.coli 或噬菌体,一、复制的起始二、复制的延伸三、复制的终止,Antibodies of dnaA,一、复制的起始,oriC,四个9bp的重复序列 dnaA结合位点,三个13bp的重复序列,若干GATC位点,一、复制的起始点
2、,oriC,一、复制的起始点,1 3-OH引发末端的产生2 单链DNA的产生3 复制复合体的形成,一、复制的起始,1、3-OH引发末端的产生,X174 噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：在复制起始点，噬菌体A蛋白使病毒（+）链产生缺口。,Three proteins unwind X174 DNA,A蛋白（gpA）：x 174基因A的产物 结合到 RFDNA的复制原点的结合位点（引发体的帮助）诱导相邻的识别位点的熔解(负超螺旋、富含A/T)其核酸内切酶活力切割（）链的4305与4306碱基 的酯键，并共价连接于5端（A），另一端为自由的 3OH（G）,2 单链DNA的产生,解
3、旋酶(helicase):使DNA的两条链分开，它通常利用ATP水解 来提供必需的能量,X174 噬菌体的DNA在三种功能蛋白先后作用下分开成为单链：Rep蛋白提供解旋酶活性，它使两链分离。,Three proteins unwind X174 DNA,Rep蛋白解旋酶,1),3),2),起始需要解旋酶、单链结合蛋白和引物酶,3 复制复合体的形成,16,DNA双链复制起始点,dnaA,dnaB/dnaC,DNA双链解开成单链DNA,SSB,引物酶,RNA引物/3-OH,DNA聚合酶,dNTP,和3-OH形成35磷酸二酯键,解旋酶,解链酶,SSB,SSB,3,3,5,5,引发体,解链、解旋酶,拓
4、扑异构酶,涉及的主要酶系：DnaA、RNApol是必不可少的，此外涉及到 DnaB（解旋酶）、DnaC、Hu、Gyrase、SSB、DnaG、Top和 DNApol 全酶,二、延伸过程,进入的标志：DNApol 把第一个核苷酸加到引物 的3OH端,1.在DNA聚合酶的作用下，2.前导链合成1000-2000个核苷酸后，3.随从链开始合成，岗崎片段的长度 为1000-2000个（大肠杆菌）4.Pol为不对称二聚体，一个作用于前导链，另一个作用于随从链(loop)。,参与复制延伸的蛋白质因子,(Dna G),(DnaB),复制体,21,图12-14,位于复制叉处的多酶复合体（引发体）必须快速 从一
5、个冈崎片段移到另一冈崎片段,In lagging Strand 上多酶系统 必须完成多次反复的启动与扩展 E.coli 启动20004000次的冈崎片段复制,复制叉处的复制体,前导链和后随链的协同合成,PriA清除SSB提供引发体移动动力极性35,一分子的 DNA pol III.协同合成前导链和后随链,25,26,5,3,3,5,图12-13,三、复制终止,1、环形DNA复制的终止 a、终止序列 E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC 每个区域只对一个方向的复制叉起作用,b、专一性终止蛋白 E.co
6、li 中由 tus gene 编码 通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用 每次复制时只使用一个终止位点,ter,2 染色体DNA的末端复制,3,5,5,3,RNA引物,3,3,RNA引物水解,即DNA复制过程不能自始至终完整地复制整个线性染色体，而是每次都在其5末端留下一个空缺未能填补（即RNA引物降解），如果细胞没有办法添补这些空隙，染色体DNA将随着每一次的细胞分裂而不断缩短，直至这种缺隙侵蚀到染色体的结构基因而使细胞消亡。,5,5,端粒的功能端粒给染色体末端提供了一个保护性的“帽子”，防止染色体的融和、丢失和降解，并参与染色体和核基质的结合。DNA复制模型中存在“末端复制问题”。真核细胞D
7、NA复制需要RNA引物，复制完成时，RNA引物被水解。这必然导致复制的随从链5端有一段缺损，而DNA聚合酶无法填补。根据此复制模型，染色体DNA面临5端缩短的趋势。端粒的存在以其长度的缩短来阻止遗传信息的丢失，从而维持了基因组的完整性，解决“末端复制问题”。,3,5,5,3,RNA引物水解,端粒 染色体DNA 端粒,末端复制补齐过程,通过TG链的回折形成 发夹结构（GG氢键）尺蠖模型,端粒酶（Telomerase）1985.Carol Greider&Blackburn,1986.Gottchling,四膜虫 端粒酶（telomerase）将T2G4 末端重复延伸 游扑虫 Telomerase
8、=RNA CAAAACCCC 链+末端结合蛋白（TBP）,端粒酶逆转录酶a、核蛋白（ribonucleoprotein RNP）b、含约长150NT的RNA，其中含 15 拷贝的CxAy重复序列，是合成端粒T2G4的模板c、延长的3-T2G4端（一段cDNA）作为5-端DNA合成的模板,端粒酶以自身含有的RNA作为模板，合成和补充端粒的重复序列，具有逆转录酶性质，是一种RNA依赖的DNA聚合酶，又称为端粒末端转移酶。可以催化端粒3 端的游离-OH基上连接新的dNTP以延长端粒序列。,端粒酶的功能端粒酶以其自身的RNA组分为模板，以原有的一条DNA单链的3端游离-OH为引物，在端粒末端添加新的端粒重复序列使端粒延长。端粒酶的作用解决了“末端复制问题”，保证真核细胞线性染色体DNA复制得以完全。端粒酶的活性决定了端粒的长度。无论单细胞或多细胞真核生物都存在各自特异的端粒酶RNA模板。,染色体DNA,端粒,端粒,39,去除RNA引物补充空缺连接,DNA聚合酶的小片段 5 3外切酶DNA聚合酶的大片段 3 5外切酶 5 3聚合酶DNA连接酶,复制忠实性的保证,
