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1、临床标本的细菌学检验,临床病原生物学教研室,血液标本的细菌学检验,目的要求 1掌握血液标本的细菌学检验程序和方法。2掌握血液标本中常见细菌的检验技术。,器材和试剂,1标本疑为菌血症患者的血液标本。2培养基硫酸镁葡萄糖肉汤、胆汁葡萄糖肉汤、硫乙醇酸钠肉汤、羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、厌氧血琼脂平板、KIA、MIU、甘露醇发酵管等。3试剂 3过氧化氢、氧化酶试剂、染色液、5g片新生霉素药敏纸片。4其他沙门菌属诊断血清、新鲜人或兔血浆。,步骤和方法,1标本采集 怀疑为菌血症的患者，一般应在发病初期采集，或在体温上升期采取；原则上应在抗生素使用前采取，对已开始抗生素治疗的患者可在下次给药前采取；大多
2、由肘静脉采取，对亚急性细菌性心内膜炎的患者采集股动脉血，也可在靠近感染病灶的部位采集。成人采血量每次510ml，儿童12ml，分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤(需氧培养)和硫乙醇酸钠肉汤(厌氧培养)培养瓶中，疑为沙门菌引起的肠热症可注入胆汁葡萄糖肉汤，轻轻摇动混匀。血液与培养基的比例应为1:10，可使血液中的抗菌物质如原有抗生素、溶菌酶、抗体和补体等充分稀释，不能发挥抗菌活性。,检验程序,常见致病菌检验及报告方式,(1)将血液细菌培养瓶置35孵育箱中孵育，每日观察1次，连续观察至第7天。注意血液细菌培养瓶的变化。(2)如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查，发现细
3、菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告。,(3)如有发现培养液浑浊、溶血、绿色色素、表面菌膜生长、胶冻状凝固或细胞层颗粒状生长，均为细菌生长现象。用无菌技术取瓶内液体接种固体培养基。需氧培养瓶接种羊血琼脂平板、巧克力血琼脂平板，前者做普通需氧培养，后者放人5CO2 环境35孵育24h；厌氧培养瓶接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，前者置厌氧环境进行35、48h厌氧培养，后者做普通需氧培养。观察菌落生长情况。,(4)对细菌菌落涂片、革兰染色，观察细菌形态及染色性。如为革兰阴性杆菌，进行氧化酶试验、触酶试验和硝酸盐还原试验，氧化酶阴性、触酶试验和硝酸盐还原试验阳性者初步判断为肠杆菌科细菌，接种K
4、IA、MIU培养基，KIA、MIU培养基上的生化结果符合沙门菌属者，用沙门菌属诊断血清做玻片凝集后确认血清型；KIA、MIU培养基上的生化结果符合肠杆菌科其他菌属，血液中常见革兰阴性杆菌的初步鉴定见表。全面鉴定参见第二章第二节进行鉴定；氧化酶试验阳性或阴性，不发酵或不利用葡萄糖者，疑为非发酵菌，参见第二章第四节进行鉴定。球菌属或肠球菌属；参见第二章第一节进行鉴定。,(6)报告方式：在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有细菌生长”；经分离培养，生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养天，有细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；如果增菌培养至7天，培养
5、瓶中仍无细菌生长迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌学培养7天，无细菌生长”。,注意事项,1一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉汤增菌液，以中和四环素、链霉素、新霉素、多粘菌素等抗生素，并添加抗菌物质拮抗剂如5对氨基苯甲酸(PABA)拮抗磺胺类、100IU50ml青霉素酶破坏青霉素和加入0.030.05聚茴香脑磺酸钠(SPS)灭活氨基糖苷类及多肽类抗生素。,2对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目翻种后无菌生长，方可报告阴性。3为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目翻种2次，第一次在标本孵育12
6、18h后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种需氧培养均需接种羊血平板和巧克力琼脂平板；厌氧培养接种厌氧血琼脂平板和羊血琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。,4血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据。常见的病原菌见表52。在同一患者的2份血液标本中检出同一细菌；或检出细菌的患者23周后血清中的相应抗体升高则可作出肯定的病原学结论。一般菌血症由一种细菌引起，但也有同时两种细菌的混合感染、两种细菌或细菌和真菌的先后交替感染情况，有时也会出现不常见的细菌，这些情况不能随意判定为污染菌。,5采血次
7、数及间隔 在脑膜炎、细菌性肺炎等需马上开始抗菌治疗的急性发热性疾病；或急性骨髓炎、化脓性关节炎等需紧急手术的患者，应立即从两臂分别取2份标本做血液细菌培养。对心内膜炎患者，在24h内采血3次，每次间隔不少于30min；必要时次日再采血2次。对不明原因发热者2次抽血间隔60min；必要时于2448h后再抽血2次。因为1次血培养不足以说明问题，且会遗漏阳性结果。,呼吸道标本的细菌检验,目的要求 1掌握上呼吸道标本及下呼吸道标本的细菌学检验程序和方法。2了解呼吸道标本的采集方法。,器材和试剂,1标本痰液标本、咽喉拭子。2培养基 血琼脂平板、巧克力琼脂平板、其他常用生化反应管。3试剂 氧化酶试剂、3过
8、氧化氢、革兰染色液、无菌生理盐水。,步骤和方法,(一)标本采集 1鼻咽拭子鼻咽拭子是将金属棉拭子的前端弯曲，高压灭菌后备用。采集时，患者先用清水漱口，对光而坐，头向上仰张大口，用压舌板轻压舌跟，取鼻咽拭子绕过悬雍垂，在鼻咽腔、悬雍垂后侧反复涂抹数次小心取出，避免接触口咽部其他组织。,2咽拭子将拭子用无菌生理盐水湿润，用压舌板轻压舌根，暴露整个口咽部。先用 拭子轻擦扁桃体表面后弃去，再取1支湿润的拭子轻压扁桃体，擦取挤压出的分泌物，或 擦取伪膜等病变部位。,3痰液标本(1)自然咳痰法：嘱受检者用清水漱口数次后，用力咳嗽自气管深部将痰液咳出吐 至无菌容器中。对痰量少或无痰等咳痰困难者，可雾化吸人4
9、5左右的10氯化钠水溶液，使痰液容易排出。对于幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽而取之。(2)气管镜采集法：用气管镜在肺内病灶处直接吸取标本或用气管刷采取标本。(3)气管或环甲膜穿刺法：主要用于厌氧菌培养。,检验程序,常见致病菌检验及报告方式,1痰液标本的检验(1)肉眼观察：下呼吸道标本为痰液，选取脓血性的痰液用于细菌学检验。异常恶臭的脓性痰，常见于肺脓疡患者，而且可能与厌氧菌有关。痰液中有颗粒状、菌块和干酪样物质可能与放线菌病和曲霉菌感染有关。(2)涂片检查：挑选痰液中脓、血性部分涂片，干燥固定后，进行革兰染色镜检。如发现形态典型、有特殊结构，初步可以确定所属菌属或种的细菌，可直接报告
10、。如查见革兰阳性葡萄状排列的球菌，可报告“痰液涂片查见革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；查见革兰阳性双球菌、矛头状，有明显荚膜时，可报告“痰液涂片查见革兰阳性双球菌，形似肺炎链球菌”。如果不能直接确定菌属或种的细菌，可报告“痰液涂片查见革兰性菌”。如果涂片中均为鳞状上皮细胞，则应视为不合格标本。,注意事项,1上呼吸道标本要及时送检，防止干燥。采集时要尽量避免正常菌群的污染。2鼻咽拭子检查脑膜炎奈瑟菌通常用于带菌者的检查，采集的标本要保温35度，防止干燥。最好床边接种，必要时使用卵黄双抗运送液。3痰液标本最好采取晨痰。,4上呼吸道有大量的正常菌群存在，正常情况下这些细菌并不致病，但在机体抵抗力下降或
11、某些外在因素作用下，可以侵入下呼吸道致病。因此要正确评价这些菌群的致病作用并不容易。特别是在抗生素作用下或在大量正常菌群掩盖下，致病菌难以检出。因此必须熟练掌握各菌群的特点和数量的关系。5白喉棒状杆菌引起的白喉是法定报告的传染病，越早诊断对治疗越有利，同时对 防止扩散有重要作用。因此需迅速而准确的检验。,尿液标本的细菌学检验,目的要求 1掌握尿液标本的细菌学检验程序和方法。2掌握尿液标本的细菌计数方法。,器材和试剂,1标本临床尿液标本。2培养基羊血琼脂平板、巧克力琼脂平板、KIA、MIU、甘露醇发酵管。3试剂 3过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、5g片新生霉素药敏纸片。4其他诊断血清、新鲜人或
12、兔血浆。,步骤和方法,1标本采集正常人的尿液是无菌的，但在尿道口及外阴部位存在正常菌群，在采集尿液标本时，极易引起污染。应遵守无菌操作，避免正常菌群的污染。,采集方法,(1)中段尿采集法：是临床上最常采用的方法。女性患者先以肥皂水清洗，而后用1：1000的高锰酸钾水溶液冲洗外阴部及尿道口，用灭菌纱布擦干，用手指将阴唇分开排尿，弃去前段尿，留取中段尿1020ml于无菌容器中加盖送检。男性患者应翻转包皮，用1:1000新洁尔灭消毒尿道口，用无菌生理盐水冲洗，无菌纱布擦干后开始排尿，弃去前段尿，留取中段尿1020ml于无菌容器中加盖送检。,(2)导尿法：用导尿管导尿收集1020ml尿液。可以避免污染
13、，但患者难以接受，而且有诱发逆行感染的危险。(3)肾盂尿收集法：由泌尿科医师在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液。(4)膀胱穿刺法：在膀胱充盈的状态下，在患者耻骨联合上用碘酒、酒精消毒后，以无菌注射器穿刺抽取尿液。此法用于尿液厌氧菌培养或儿童留取中段尿困难者。(5)留尿法：留取24小时尿液，取沉淀部分约100ml送检。主要用于疑为泌尿道结核患者的检查。,检验程序,(1)尿液的菌落计数 1)直接计数法：将尿液标本混匀，取1滴尿液于载玻片上，覆盖盖玻片，用相差显微镜观察每个视野的细菌数，可大致估计尿液中的细菌数。如每视野有100个以上的细菌则尿液中的细菌数约为107菌数/ml，每视野有10个以上的
14、细菌则尿液中的细菌数约为105菌数/m1，每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为104菌数/ml；可同观察细菌的形态和运动情况。也可将0.001ml尿液涂布在玻片上进行革兰染色，用油镜观察，如每视野有1个以上的细菌则尿液中的细菌数约为105菌数/ml。,2)定量接种法：用定量接种环取尿液，在血平板上连续划线接种；或用无菌移液器吸取0.1ml尿液标本用9.9ml无菌生理盐水稀释后，取0.1ml于血平板上涂布接种，35孵箱中孵育1824h，计数平板上生长的菌落数。再计算每毫升尿液中细菌数。每毫升尿液中细菌数=平板上的菌落数x 1/接种环含尿量(ml),3)倾注培养法：取0.1ml尿液标本用9.
15、9mL无菌生理盐水稀释后，取1ml于无菌平皿中，加入已溶化并冷却至50的普通琼脂培养基，立即混匀，凝固后35孵箱中孵育1824h，计数平板上生长的菌落数。乘上100，即得每毫升尿液中的细菌数。,4)报告方式：平板上如有细菌生长，计数菌落后，报告“每毫升尿液中细菌数为”；如无细菌生长，经48h培养后仍无细菌生长，报告“普通需氧培养48h无细菌生长”。,(2)普通需氧培养：将尿液标本离心，取沉淀接种于血琼脂和麦康凯平板，35孵育1824h，观察有无菌落生长，根据菌落特征和革兰染色镜检结果选择鉴定试验。,注意事项,1若革兰阴性杆菌尿液菌落计数105/ml可判断为感染，104/ml105/ml为可疑需
16、重复检查。对于革兰阳性球菌而言尿液菌落计数104/ml可判断为感染菌。2尿路感染一般由单一细菌引起，偶尔也可由一种以上细菌引起。当同一份标本中同时检出三种或三种以上细菌时，标本污染可能性大，需重新留取标本检查。,3尿液是良好的细菌生长环境，采取后应立即检验，放置时间过长会导致感染菌和杂菌过度生长，影响诊断的准确性。不能及时接种的标本可临时存放4冰箱，但不得超过2h。4菌落计数的影响因素较多，与抗生素的使用、输液、使用利尿剂、尿液的pH变化和细菌种类有关。5尿液标本中不得加入防腐剂和消毒剂。6为了避免变形杆菌迁徙生长而污染其他标本，每个平板只能接种一个尿液标本。也可使用抑制变形杆菌迁徙生长的培养
17、基如麦康凯、CLED培养基。,肠道标本的细菌学检验,目的要求 1掌握粪便标本的采集方法。2掌握粪便标本的细菌学检验的程序和方法。,器材和试剂,1标本粪便标本或肛拭子。2培养基SS琼脂平板，麦康凯琼脂平板，中国蓝蔷薇色酸平板，KIA，MIU，GN增菌液，碱性蛋白胨水，TCBS平板，副溶血弧菌选择平板。3试剂靛基质试剂，志贺菌属诊断血清，沙门菌属诊断血清，和霍乱弧菌诊断血清，肠致病性大肠埃希菌、肠侵袭性大肠埃希菌诊断血清。4其他显微镜、生理盐水、玻片。,步骤和方法,1标本的采集和运送应采集可疑粪便，如痢疾患者的粘液脓血便，霍乱患者的“米泔水样”便等。疑为霍乱的患者，应置碱性蛋白胨水中。对不易获得粪
18、便时或排便困难的患者或幼儿，可采取肛拭子，将拭子用生理盐水湿润，插入肛门内45cm(幼儿约23cm)处，轻轻转动采取直肠表面粘液后取出，置无菌试管中送检。如不能及时送检，可将 粪便标本或肛门拭子插入卡一布运送培养基中。,检验程序,常见致病菌检验及报告方式,(1)志贺菌属和沙门菌属：将急性腹泻患者的粪便标本划线接种于ss平板和麦康凯平板，35培养1824h。对慢性腹泻可疑志贺菌感染的患者或携带者应接种GN增菌液，对可疑沙门菌感染的患者或携带者接种亚硒酸盐增菌液，35培养6h，再转种至SS平板和麦康凯平板，35培养1824h。观察有无小的、透明或半透明、无色的可疑菌落生长，有时SS平板上可见黑色菌
19、落中心。挑选两个可疑菌落，用接种针在可疑菌落的中心挑取细菌，分别接种2支KIA和MIU培养基中。35培养1824h，观察反应结果。如果KIA和MIU培养基上的生化反应结果与表56中的志贺菌属相符，则应初步认为该菌株属于志贺菌属，用志贺菌属诊断血清对KIA管生长的细菌进行凝集，先用多价血清进行凝集，再用分型血清进行玻片凝集，得出最后分型鉴定结果。,如果KIA和MIU上的结果符合表56中的沙门菌属的生化反应结果，则应初步认 为该菌株属于沙门属，需与肠杆菌科的其他菌属进行鉴别，见表57，确定为沙门菌属细 菌。然后参照第二章第二节“志贺菌属和沙门菌属”，用沙门菌属诊断血清对KIA管生长的细菌进行凝集。
20、1)先用AF多价O血清进行凝集，如果凝集，再用分群O血清进行玻片凝集，确定并记录O抗原型别。2)用H抗原第一相抗血清进行凝集，确认凝集后。记录H抗原的第一相抗原型别。3)根据记录的O、H抗原型别，查沙门菌属抗原组成表，确定菌株的血清型和菌名。4)如果沙门菌属抗原组成表有两种以上的血清型抗原组成与本实验的分离菌株相同，则需凝集H抗原的第二相。记录抗原型别并查沙门菌属抗原组成表，确定菌株的血清型和菌名。5)如果仍有两种以上的血清型抗原组成相同，则需参照抗原组成表中推荐的补充生化反应进行鉴定。6)AF多价O血清进行凝集时，如果不凝集，则可能在菌株表面有Vi抗原存在，需100水浴30min处理后，重复
21、以上的实验步骤，确定型别。如果仍然与A-F多价O血清不凝集，则可能为非A-F群沙门菌，可以丢弃。,报告方式：,如未检出志贺菌属和沙门菌属，则报告“未检出志贺菌属细菌”、“未检出沙门菌属细菌”。如果检出的菌株生化反应与志贺菌属符合，且与志贺菌属的某个血清型抗血清凝集，则报告“检出型志贺菌”。如果检出的菌株生化反应与沙门菌属符合，且与沙门菌属的某个血清型抗血清凝集，则报告“检出x型沙门菌”。,注意事项,1肠道内存在大量的正常菌群，除非为了正常菌群的调查和鉴定，一般分离可疑致病菌应使用选择性平板。2最好采集急性期，抗生素使用前的粪便标本，进行床边接种。3除怀疑霍乱弧菌、结核分枝杆菌和菌群失调引起的腹泻外，粪便标本一般不做涂片检查。在以糖类发酵为鉴别依据的培养基上，发酵型菌落进行氧化酶试验时会出现假阴性。在选择性平板上挑取菌落时，应使用接种针从菌落中心挑取，而不应使用接种环刮取菌落。4沙门菌属容易丢失鞭毛抗原，此时要通过诱导使鞭毛恢复，才能鉴定。,
