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1、1,第三章,发酵工业原料及其处理,2,本章内容,一、发酵工业原料的种类和成分二、淀粉水解糖的制备三、发酵培养基灭菌,3,第一节 发酵工业原料的种类和成分,发酵培养基的作用：满足菌体的生长 促进产物的形成,4,要求营养丰富完全，有利于产物合成；不能大量加入快C、快N源，应和慢C、N源相结合；在产物分泌期间，pH 稳定；加入适量合成所需的物质，如前体等，进行定向发酵；采用中间补料，以提高发酵单位；原料的考虑成本问题,5,一、工业上常用的碳源（carbon source）,工业上常用的糖类及来源,6,谷物淀粉优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。谷物淀粉缺点：a.难利用、发酵液比较稠、一般2.0
2、%时加入 一定的-淀粉酶。b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。,7,有机氮：来源：一些廉价的原料，如玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、酵母浸出膏等。,二、工业上常用的氮源（nitrogen source）,8,9,1、无机盐：硫酸盐、磷酸盐、氯化物及一些微量元素。,三、发酵培养基中的无机盐和生长因子,10,提供生长因子的农副产品原料:（1）玉米浆（最具代表性)（2）麸皮水解液（3）糖蜜（4）酵母,2、生长因子（growth factor）,11,1、前体：能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量有较大的提高。在生产中常采用少量多次地加入前体。
3、,四、发酵生产的前体物质和促进剂、抑制剂等,12,13,2、促进剂 所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,14,15,3、抑制剂 抑制某些代谢途径的进行，同时刺激另一代谢途径，以致可以改变微生物的代谢途径。,16,某些代谢产物的抑制剂,17,在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。,第二节 淀粉水解糖的制备,18,一、淀粉相关知识,19,直链淀粉100-60 000,-1，4糖苷键,-1，4糖苷键,-1，6糖苷键,支链淀粉1 000-3 000 000,普通谷物和薯类淀粉含直链淀粉17%-
4、27%，其余为支链淀粉；粘玉米、糯米全部为支链淀粉,2、淀粉的分子结构,20,二、淀粉水解糖的制备方法和原理,（一）酸解法（二）酶解法（三）酸酶结合水解法,21,（一）酸解法,以酸（无机酸或有机酸）为催化剂，在高温高压下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。,22,1.水解过程：总反应式：(C6H10O5)n+nH2O nC6H12O6过程：(C6H10O5)n(C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6 淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。,23,2.副反应葡萄糖的复合反应和分解反应,水解反应,复合反应,分解反应,24,葡萄糖,葡
5、萄糖,25,影响复合反应的因素：,1）葡萄糖浓度,3）酸的种类和浓度,4）温度,DE值：dextrose equivalent value（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（）DE值 100 干物质含量（）,2）淀粉乳浓度,26,影响分解反应的因素：,1）糖化加热时间,3）葡萄糖浓度,2）酸度,27,（1）降低了葡萄糖的收率。（2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。复合反应：生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。分解反应：生成的5羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。,不利影响：,28,如何控制分解反应和复合反应的发生？（1）淀粉乳浓度（2）酸浓
6、度 不能过高（3）温度,29,3.评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。,30,淀粉,盐酸,蒸汽,水,调浆,糖化,冷却,中和脱色,压滤,滤渣,糖液,活性炭,Na2CO3,4.酸解工艺流程,淀粉的酸水解工艺是根据淀粉在水解过程中的水解反应和复合、分解反应规律性来决定的。,31,1 淀粉质量 2 淀粉乳浓度的选择 3 酸的种类和用量 4 糖化温度、压力和时间 5 糖化终点,32,（二）酶解法,用专一性很强的淀粉酶及糖化酶将淀粉水解为葡萄糖的工艺。,33,淀
7、粉酶解法分两步：（1）液化：用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。,34,酶 水解位置 水解次序 水解产物液化 淀粉酶 1，4糖苷键 无先后次序 葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖 异麦芽糖、低聚糖糖化 糖化酶 1，4和1，6 从非还原性 葡萄糖 糖苷键 末端开始,1.酶水解特性,35,2、淀粉的液化及液化终点的控制糊化：在温水中，当淀粉颗粒无限膨胀形成均一的粘稠液体的现象，称为淀粉的糊化。此时的温度称为糊化温度。老化：分子间已断裂的氢键、糊化淀粉又重新排列形成新的氢键的过程，也就是复结晶的过程。,36,液化方法,37,喷射液化,该工艺的
8、特点是利用喷射器将蒸汽喷入淀粉乳的薄膜，在短时间内通过喷射器快速升温至145C完成糊化、液化，使形成的“不溶性淀粉颗粒”在高温下分散，从而使所得的液化液既透明又易于过滤，淀粉的出糖率也高，同时采用了真空闪急冷却，提高了液化液的浓度。,38,液化程度的控制,I2试测定DE值DE值高，糊精太小，不利于糖化酶作用，影响催化效率，终点DE值低。DE值低，液化不彻底，糖化速度慢，酶用量大，时间长，过滤性能差。,39,3.淀粉糖化及糖化终点的控制,（1）糖化的温度及p值：决定于所用的糖化剂的性质。（2）加酶量：（3）液化液DE值的影响：在碘试本色的前提下，液化液DE值越低，则糖化液DE值越高。（4）异淀粉
9、酶的影响：,40,糖化终点：终点确定：DE值达最高时，加热灭酶方法：无水乙醇滴入糖化液，无白色沉淀则达到糖化终点,41,糖化工艺,液化 糖化 灭酶 过滤 成品糖液,42,4.评价 优点：（1）反应条件温和，不需高温、高压设备。（2）副反应少，水解糖液纯度高。（3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓度下水解。（4）糖液颜色浅，质量高。,缺点：（1）生产周期长，一般需要48小时。（2）需要更多的设备，且操作严格。,43,（三）酸酶结合水解法,44,1）酸酶法：,酸解,酶解,酸酶法特点：液化速度快；糖化是由酶来进行的，对液化液要求不高，可采用较高的淀粉乳浓度，提高生产效率；用酸较少，产品颜色
10、浅，糖液质量较高。,45,2）酶酸法：,酶酸法特点：可采用粗原料淀粉，淀粉浓度也较酸法高，糖液色浅,46,从水解糖的质量及降低糖耗，提高原料利用率方面来考虑，则以双酶法最好，酸酶法次之，酸法最差；从时间来说，则酸法最短，双酶法最长,47,淀粉水解糖液质量要求,1、色泽：淡黄色透明 2、糖液不含糊精 3、还原糖含量：18%（酸解法）；25-38%（酶解法）4、DE值：90%（酸解法）；95%（酶解法）5、透光率：40%（酸解法）；60%（酶解法）6、pH:4.6-4.8 7、淀粉转化率：92%（酸解法，玉米淀粉糖）；95%(酶解法，玉米淀粉糖）；87%（酸解法，大米糖）,48,第三节 发酵培养基
11、灭菌,一、消毒与灭菌的原理和方法,1、在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果：1、生产菌和杂菌同时生长，竞争培养基中的营养物质，导致生产能力下降；2、杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难；3、杂菌大量繁殖，改变代谢途径，使生物反应产生异常变化；4、杂菌会降解目的产物，使生产过程失败；5、发生污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,49,2、灭菌与消毒的区别灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,50,3、灭菌的原理和方法干热灭菌法湿热灭菌法射线灭菌法化学药品灭菌法过滤除菌法火焰灭菌法,51,（1）干
12、热灭菌,原理：利用高温对微生物有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。常用方法：灼烧和电热箱加热，140-180 1-2小时 使用范围：玻璃及金属用具及沙土管灭菌,全自动干热灭菌器,52,（2）湿热灭菌,原理：蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。常用方法：水煮常压灭菌：100饱和蒸汽灭菌：一般121，30分钟使用范围：培养基和发酵设备灭菌。,高压蒸汽灭菌锅,53,（3）辐射灭菌,原理：利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。常用：紫外线、X射线和射线。使用范围：用于室内空气及器皿表面灭菌,微波灭菌机,54,（4）化学物质灭菌原理：药物与
13、微生物细胞中的成分反应，使蛋白质变性、酶失活。使用范围：器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌,55,常用的灭菌剂,56,（5）过滤除菌,原理：利用微生物不能透过滤膜除菌。方法:0.010.45 m孔径滤膜，使用范围：用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。,57,（一）湿热灭菌的原理1、微生物的热阻,二、培养基与设备的灭菌,致死温度：杀死微生物的极限温度。致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间,58,某些微生物对湿热的相对热阻（与大肠杆菌比较）,热阻，指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另
14、一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,59,2.微生物热死定律：对数残留定律,在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即 当Nt=0时，t=，既无意义，也不可能。一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。,1,2,3,可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数Nt）和值,60,斜率：-k,61,非对数残留定律：,62,：反应速率常数（比死亡速率常数）,死亡速率 常数 是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。,反应速率常数k与灭菌温度T的关系：阿累尼乌斯方程：k=Ae-E/RT
15、,Svante August Arrhenius was a Swedish physical chemist best known for his theory that electrolytes,certain substances that dissolve in water to yield a solution that conducts electricity,are separated,or dissociated,into electrically charged particles,or ions,even when there is no current flowing t
16、hrough the solution.In 1903 he was awarded the Nobel Prize for Chemistry.,63,121某些细菌芽孢的值,64,（二）灭菌温度与时间的计算和选择,培养基成分受热破坏是化学分解反应，为一级动力学反应：,-dC/d=C,培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。,65,ln(2/1),ln(2/1),E,E,ln2/1ln2/1,当灭菌温度升高时，微生物死亡速率大于培养基成分破坏的速率。,66,根据这一理论，培养基灭菌采用高温短时的方法，有利于减少营养成分的破坏。,67,（三
17、）影响培养基灭菌的因素,在影响培养基灭菌的因素中，除了灭菌温度和时间外，还有以下影响因素：1.培养基成分：油脂、糖类、蛋白质增加耐热性，灭菌时间长；高浓度的盐类、色素等则削弱其抗性 2.培养基物理状态：固体培养基的灭菌时间要比液体培养基的灭菌时间长,68,3、pH,微生物在pH6.08.0范围内耐热性最大 pH低于6.0时，氢离子极易渗入微生物细胞，从而改变细胞的生理反应而促进其死亡，故培养基酸度愈高，则所需的杀菌时间愈短。,69,4、培养基中微生物数量,数量越多，所需灭菌时间越长,例如：如肉毒梭状芽孢杆菌，在105湿热灭菌时间 芽孢杆菌数/ml 时间(min)9108 48 9106 36
18、9104 20 9102 14 9 2,70,5.微生物细胞含水量：一定范围含水越多蛋白质凝固温度越低，越易被杀死。6.微生物细胞菌龄：7.耐热性：8.泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂。,71,（一）间歇灭菌,三、发酵培养基灭菌工艺,间歇灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程，也称分批灭菌或实罐灭菌。,72,过程包括：升温、保温和冷却三阶段。各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、5%。,培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况,1.间歇灭菌的温度变化,73,例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121温度下进行实罐灭
19、菌。原污染程度为每ml有2105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速度常数为1.8min1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,2.灭菌时间的估算,74,1、在进行培养基灭菌之前，通常应先把发酵罐的 空气分过滤器灭菌并用无菌空气吹干。2、预热：向夹套或蛇管中通入蒸汽，间接将培养基加热至70左右 作用：利于糊化；减少冷凝水的生成；减轻噪音,3.间歇灭菌工艺过程,75,3、开启蒸汽管，向培养基中通入蒸汽，升温。,4、罐压达0.1 MPa时，调节装在发酵罐封头的接种管、补料管、消泡剂管，进行排气。,升 温 阶 段,76,5、保温 调节好各进汽和排汽阀门，使罐压和温度 保持在一稳定水平，维持一定时
20、间。,在保温阶段，凡进口在培养基液面下的各管道都应通入蒸汽；在液面上的其余管道则应排放蒸汽，这样才能保证灭菌彻底，不留死角。,保 温 阶 段,77,三路进汽：直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。,*,四路出汽：直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气,间歇灭菌设备示意图,78,6、保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀；待罐 压低于空气压力后，向罐内通入无菌空 气，向夹套或蛇管中通入冷水，使培养基降至所需温度。,通入无菌空气的作用：加速降温；保持罐内正压,降 温 阶 段,79,将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时加热、保温和冷却，进行灭菌。,（二）连续灭菌,80,灭菌过程中温度的变化,81,连续灭菌流程,82,配料罐（兼作预热）,输料泵,连消塔（器）,维持罐（管）,冷却器,发酵罐,配制好的料液预热至60-70,用高温蒸汽使料液温度很快升高到灭菌温度（126132C）；,使料液在灭菌温度下保持57min。,使料液冷却到4050C后（冷水喷淋），输送到预先灭菌过的罐内。,83,84,（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较,
