第15章动物干细胞技术.ppt.ppt

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1、小组成员介绍：,邵海娜 王 霞 董 欢 吕瑾美 周玉红 孙转平 姜伯玲 毛玉珊 田春艳,王 瑞 陶丽红 李翡翡,第一节,第二节,第三节,ES/EG细胞培养建系技术,ES/EG细胞体外诱导分化,ES/EG细胞技术的应用,第四节,干细胞概论,第十五章 动物干细胞技术,干细胞具有无限增殖和自我修复能力，他们至少能分化为一种类型的机体细胞，其中胚胎干细胞具有体外培养无限增殖、自我更新和分化为三个胚层组织细胞的能力，因而被称为“万能细胞”,动物干细胞技术：就是通过各种方法获得干细胞，经体外培养建立细胞系，并对其进行定向分化诱导研究，以期获得需要的某一特定类型细胞。,第一节 干细胞概论,一、干细胞的定义和

2、分类 二、干细胞的研究发展,一、干细胞的定义及分类,干细胞（stem cell）：是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。,1.定义:,2.分类,根据细胞分化潜能大小：全能干细胞（totipotent stem cell）三胚层多能干细胞（pluripotent stem cell）单胚层多能干细胞（multipotent stem cell）单能干细胞（monopotent stem cell）,全能干细胞(胚胎干细胞)：具有形成完整个体的分化潜能。如：胚胎干细胞(ES)具有很强的分化能力，可无限增殖并分化为全身200多种细胞类型，及机体的各种组织、器官。

3、,多胚层多能干细胞：指失去了发育成为完整个体的能力，但仍具有分化成个体中包括生殖细胞在内的各种细胞的潜能。如：囊胚的内细胞团细胞及源于内细胞团的胚胎干细胞等。,单胚层多能干细胞：只能分化成几种特定类型的细胞，分化潜能较窄。如:间充质干细胞。,单能干细胞：只能分化为一种细胞。如：成体干细胞中的神经干细胞。,根据细胞来源不同：,干细胞,胚胎性干细胞：指源于囊胚内细胞团（ISM）的胚胎干细胞（ES）。它均属于三胚层多潜能性干细胞。如：ES细胞、EG细胞、EC细胞等。,成体干细胞：是指那些具有组织特异性的细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分

4、化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。如：神经干细胞，表皮干细胞。,ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干细胞。EG细胞：来自于早期胚胎嵴原始生殖细胞的多能干细胞。EC细胞：来自于自发或诱发的生殖细胞瘤或畸胎瘤中的多能干细胞。,二、干细胞的研究发展简史,（一）胚胎干细胞（二）胚胎生殖细胞（三）成体干细胞,（一）胚胎干细胞 1.定义：ES细胞一般是 从发育早期的胚胎内细胞团中分离培养出来的一种具有自我更新、无限增殖能力的干细胞，细胞直径为1215微米,细胞集落特征明显。,2.胚胎干细胞的发展史（1）Evans和Kaufman（1981）首次分离得到小鼠ES细胞，他们将回收

5、的胚胎体外培养于STO细胞饲养层上得到了小鼠ES细胞系。（2）Wobus等（1984）首次用小鼠胎儿成纤维细胞（PMEF）为饲养层建立了小鼠ES细胞系。,（3）Pease等（1994）借助重组白血病抑制因子（LIF）代替成纤维细胞饲养层，分离得到三个ES细胞系。（4）Munsie等（2000）从以小鼠颗粒细胞为核供体构建的重组胚ICM中分离出了核移植ES细胞，它具有正常小鼠细胞的形态特征和细胞表面标记。目前，小鼠ES细胞的分离方法基本成熟，已被广泛运用于生命科学研究的多个领域。,3.ES细胞的生物学特性（1）来自正常的胚胎具有完整的二倍体核型；（2）体积小、核大、胞质少，有1或2个核仁，细胞间

6、紧密的聚集在一起，细胞间界限不清，呈集落型生长，集落边缘清晰，遮光性强。（3）表达早期胚胎细胞特异表达的基因，如：AKP、高端粒酶基因活性。,（4）无限增殖能力。（5）广泛的体外分化能力。（6）广泛的体内分化能力。（7）具有种系传递动能。（8）在体外培养、克隆、冻存及进行遗 传操作（导入基因、标记基因或剔除基因）。,（二）胚胎生殖细胞,原始生殖脊细胞（PGC）：即EG细胞，直径为1518微米，其细胞形态、生长行为和发育潜能类似于ES细胞。,形成过程,内细胞团 原始内胚层 外胚层的生殖层 PGC顺着背部间充质迁移 生殖脊 EG细胞,胚胎生殖细胞研究史,（1）Matsui等（1992）以附值后小鼠

7、胎儿生殖脊的PGC为材料首次分离得到小鼠EG细胞系。（2）Setwart等（1994）从7个品系小鼠胚胎分离建立了3个EG细胞系。目前对小鼠EG细胞建系研究结果表明，多种品系小鼠来源的PGC可以建立EG细胞系。,（三）成体干细胞,来源很多，包括：造血干细胞 神经干细胞 间充质干细胞 表皮干细胞,成体干细胞的研究史,20世纪初,Pappenheim等首次提出了AS的概念.20世纪50-60年代,发现多种组织中存在AS1997，Dolly，体细胞的全能性1999年12月美国科学家Goodell发现，小鼠肌肉组织干细胞可以“横向分化”成血液细胞。这一发现立即被世界各地的科学家所证实，研究发现人的成体

8、干细胞同样具有“横向分化”的功能，而且具有相当的普遍性。,1.造血干细胞（HLC）,（1）概念：骨髓、外周血、脐带血等造血组织内的一类能分化成各种血细胞的原始细胞。（2）基本特征：能够自我维持、自我更新的能力（3）应用：治疗白血病、慢性白血病、地中海贫血、神经母细胞瘤等（4）优点：无来源限制，对HLA配型不高、不易受病毒或肿瘤的污染。,造血干细胞（HLC）,2.神经干细胞(NSC),存在部位：中枢神经系统中保持分裂和分化能潜能，可分化成中枢神经系统的某些细胞类型。应用：治愈帕金森综合症部分患者的症状（移植含有多巴胺生成细胞的人胚胎瘤组织）,3.间充质干细胞（MSC）,概念：存在与骨髓中不同于造

9、血干细胞，可分化为多种间充质组织（骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质等)细胞。来源不同或在不同条件下，间充质干细胞可分化相应组织细胞。地塞米赛是MCS非特异诱导剂，使其分化为骨及脂肪组织。两性霉素B是其分化为肌细胞。由于间充质细胞在体外可以相对容易地诱导出骨细胞、软骨细胞，可在骨损伤、先天性骨畸形有治疗中有广泛应用。,间充质干细胞（MSC）,MSC的优点 A、植入体内的 MSC，可在多种造血以外的组织，如肺、肝、骨、软骨、皮肤等处定位和分化，形成相应的细胞表型。B、MSC移植后不发生免疫排斥反应或反应程度较低，好控制。C、MSC可向受损肌肉组织处迁移并参与新肌肉的产生。,4、表皮干细胞,表皮

10、干细胞位于表皮基底层。（1）属于专能干细胞。能周期性的进入分化程序，最终分化为角质细胞。具有强大的增殖分化潜能。（2）属慢周期细胞。保留自我更新能力，保持基因的稳定。在治疗烧伤方面有重要作用。,利用成体干细胞的限制因素：,含量极微很难分离和纯化数量随年龄的增长而降低不可能代替ES细胞,第二节 ES/EG细胞培养建系技术,ES细胞建系：,将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）与抑制分化物共培养，使之增殖并保持未分化状态，随着传代数的增多，细胞数量越来越多，直到建立ES细胞系。,EG细胞建系：,EG细胞在体外培养增殖能力较ES细胞弱，所需条件特别是饲养层较ES细胞严格，所以EG细胞培养建系较ES细胞困难。,E

11、S/EG细胞系建立的意义:,为研究哺乳动物发育和遗传以及细胞分化提供了大量的种源细胞。真正意义上的ES/EG细胞建系要求形成生殖系嵌合体后代,一、ES细胞的来源二、ES细胞的分离三、饲养层细胞饲养法四、无饲养层培养五、ES细胞的原代培养和继代培养六、ES/EG细胞系的特性和鉴定,ES细胞的来源的途径：,早期胚胎妊娠早期胎儿组织体细胞核移植胚胎诱导多功能性干细胞（IPS）,（一）早期胚胎（主要来源）,直接从动物体内获取的胚胎：质量好、分离 ES细胞的理想材料来源体外受精所得胚胎 孤雌激活得到的囊胚,自然发情超数排卵,小鼠早期胚胎的获取：,810周龄雌性小鼠,腹腔注射PMSG 5 IU,腹腔注射h

12、CG 5 IU 与同种公鼠同笼过夜,无菌剖取子宫,采集桑椹胚或囊胚,下午6:00,间隔48h,配种后第45天,切开法/冲洗法,（二）从终止妊娠早期的胎儿组织中分离出多功能性干细胞,小鼠妊娠8.512.5天胎儿,无菌剖离出生殖脊,剖取包含原始生殖细胞的生殖脊组织,37消化515min,收集PGC单细胞悬液,接种在饲养层,清洗,解剖镜镊子,0.25胰蛋白酶,0.04EDTA消化液,离心,基本流程,（三）体细胞核移植,正常动物卵细胞,细胞融合,去核卵细胞,形成胚囊,分离出ES细胞,特定单个体细胞,机械法/化学法,除过卵/精细胞的细胞,电融合法化学融合法,（四）诱导多功能性干细胞（IPS）,将体细胞经

13、诱导重编程而逆转为ES细胞状态：利用病毒载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4 和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干的一种细胞类型。,ES细胞的分离方法：,1.全胚培养法：将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，继代培养，克隆增殖。,2.免疫外科ICM培养法：先用链酶蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养和扩增。,3.机械剥离ICM培养法：采用机械法除去胚胎滋养层细

14、胞来分离培养ICM。4.克隆法：将（转基因）成纤维细胞注入去核哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚。分离ES细胞与全胚培养法相同,饲养层细胞的种类,MEF饲养层细胞培养法,三、饲养层细胞培养法,（一）,（二）,（一）,饲养层细胞的种类,1.饲养层细胞的定义,3.STO细胞,2.小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）,4.SNL细胞,1.饲养层细胞的定义,定义：在细胞培养中起分化抑制作用的单层贴壁细胞,所谓滋养层细胞就是指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。是细胞培养，尤其是胚胎干

15、细胞培养常用的生长增值促进剂和分化抑制剂。,2.小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）,作用：能有效促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化的二倍体状态和全能性（LIF、bFGF）,优点：取材容易，价格低廉，分泌效果好,缺点：不能在体外长期传代，不能用于转染外源基因的胚胎干细胞的筛选,STO,T,O,S,SIM小鼠胚胎,硫代鸟嘌呤,鸟本苷有抗性的成纤维细胞系,3.STO细胞,作用：分泌SCGF、LIF,4.SNL细胞,STO细胞,SNL细胞,neo抗性基因,LIF基因,作用：LIF基因：抑制胚胎干细胞的分化neo抗性基因：用于转基因胚胎干细胞的筛选,优点：免去了准备原小鼠的繁琐工作,1.MEF的分离与培养,2.

16、MEF饲养层的制备,MEF饲养层细胞培养法,（二）,1.MEF的分离与培养,妊娠1214天母鼠 胎儿 躯干部剪碎 消化 离散细胞 离心 制细胞悬液 计数 培养 制成单细胞悬液 传代培养,断颈处死,无菌,去除头、四肢、内脏、尾,眼科剪,0.25胰酶+0.04EDTA,37、1015min,1000r/min、5min,细胞培养液,37、5CO2、,饱和湿度,0.25胰酶+0.04EDTA,2.MEF饲养层的制备,1.取生长旺盛的培养皿+死裂霉素C10g/mL处理23h,2.吸去处理液，清洗，制成单细胞悬液（0.25胰酶+0.04EDTA）,3.细胞计数并调整浓度为3.010 个/mL,5,4.在

17、6孔培养板中每孔加入0.6mL细胞悬液37、5CO2的培养箱内培养,四 无饲养层培养,原理:在细胞培养液中添加ES细胞抑制因子使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态,（一）培养基的组成,常用的基础培养基有:DMEM TCM-199 及F-12等,在基础培养基中添加不同的因子或改变培养条件，形成三中最常用的ES细胞培养基,1.直接在基础培养基中加入重组LIF（白血病抑制因子）,抑制胚胎肝细胞的自主分化 促进8细胞周期以后的桑椹至LIF的功能 着床前胚胎的发育 促进滋胚层细胞增殖和内细 胞团生长,2.BRL（Buffalo大鼠肝细胞株）条件培养基,分泌一种抑制畸胎瘤和胚胎干细胞 自主分化 因子

18、BRL 分泌IGF-I,3.大鼠心肌条件培养基,具有与LIF条件培养基相同 心肌条件培养基的作用 促进胚胎肝细胞貼壁和生长,表皮生长因子（EGF）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）ES细胞 中常用的 干细胞生长因子（SCF）生长因子 胰岛素样生长因子（IGF）,（二）培养方法,扩张囊胚或孵化胚 分离ICM细胞 挑取形态典型的ICM集落 转入ES细胞培养液中进行剥离转入培养基进行培养,实体显微镜下,用0.25胰酶和0.04,EDTA消化液消化35min,用孔径适当的吸胚管吹打成单细胞或小细胞团块,制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养（37、5%CO2和饱和湿度）。离散

19、的ICM或ES细胞重新接种饲养层后，可出现各种细胞集落，挑选生长良好，没有分化迹象的ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般间隔45天用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。ES/EG的亚克隆对外界条件的要求十分苛刻，如PH，酶，温度，培养液成分，细胞密度以及冷冻复苏等体外不稳定环境因素均影响着ES细胞的分离和克隆。,五.ES细胞的原代培养和继代培养,（二）、ES细胞的继代培养,初次传代后23天将出现小的ES细胞集落。待ES细胞集落充分增值而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，后面每隔46天传代一次。对E

20、S/EG细胞进行消化传代总的原则是尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度且能将集落消化成小细胞团块（图15-3）。,（三）、ES细胞的冷冻与解冻,在ES细胞传代过程中，因其耐受性差需不断对细胞行冷藏。方法为取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。冷冻液为75%DMEM+15%新生牛血清（NCS）+10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻开始温度下降速度保持在13/min为宜，当温度下降到-20左右时下降速度可调为5/min,到-100左右时，可迅速投入液氮。,解冻时，从液氮中将冷冻管取出37水浴中直到溶解70%的酒精消毒冷冻管外壁加入ES细胞培养液离心2次除去冷冻液弃去上清液，以培养液重

21、新悬浮细胞再放入CO2培养箱培养。,六、ES和EG细胞系的特性和鉴定,（一）ESEG细胞系的特性,1.无限增殖性,2.分化潜能性,3.种系传递性,在不分化的前提下，ES细胞体外增殖迅速，每1824h增殖一次。增殖过程中细胞大多处于S期，进行DNA的合成，1、2期很短，它没有G1期检测点，不需要外部信息启动DNA复制。,1.无限增殖性,2.分化潜能性 ES细胞是一种具有高度分化潜能的细胞，可以分化形成包括三个胚层在内的各种类型细胞。当ES细胞培养体系中去除抑制分化因素时，便能自发分化为血细胞、内皮细胞、肌细胞和神经细胞等。ES细胞在体外某些物质的诱导下可以发生定向分化。,3.种系传递性 将ES细

22、胞注入囊胚后发育可获得嵌合体，并参与生殖细胞的合成。在嵌合体中一部分组织和细胞来源于受体囊胚细胞，而另一部分来源于ES细胞。,（二）ESEG细胞的鉴定方法 ES细胞的鉴定方法有形态学特征、特异性标记分子的表达、分化潜能测定和嵌合体的形成等。,1.形态学特征 ES细胞较小，核质比高，细胞核显著，有一个或多个核仁，染色体正常，具有稳定的二倍体核型，染色质较分散，细胞呈多层集落状生长，无明显细胞界限，边缘整齐，折光性强。,ES细胞,小鼠ES细胞集落,人ES细胞集落,2.特异性标志分子的表达1）Oct-4 是含pou结构域的转录因子家族中的一员，被广泛的应用于鉴定胚胎性干细胞是否处于未分化状态。它最早

23、表达于8细胞时期，在每个卵裂球中都可检测到其表达产物；囊胚期后，其表达局限于内细胞团细胞；到原肠形成后，只能在原始生殖细胞中检测到它的表达。,未分化的ES细胞OCT-4 染色阳性,2）碱性磷酸酶（AKP）未分化的细胞表面标记AKP呈阳性，细胞一旦分化，则AKP呈阴性。3）阶段特异性胚胎细胞表面抗原（SSEA）SSEA是一种糖蛋白，在未分化多能干细胞中SSEA常为阳性，但它的表达具有种属特异性。,未分化的ES细胞AKP 染色阳性,未分化的ES细胞SSEA-3 染色阳性,3.分化潜能的检测1）体外分化潜能检测 包括自发分化和定向诱导分化。自发分化是将ESEG细胞接种于缺乏饲养层细胞的琼脂平板上培养

24、34天形成类胚体，培养810天，形成囊状胚体。ES细胞的定向诱导分化是在ES细胞悬浮培养液中添加相应的分化诱导因子，使ES细胞想特定的方向分化。常见的分化诱导剂有视黄酸、3-甲氧苯丙胺和神经生长因子等。,类胚体,2）体内分化潜能检测 取与ES细胞同一品系的小鼠，进行腹股沟接种或腹腔注射，一定时间后接种细胞处出现肿块并进一步增大。在肿块切片上就可观察到多种类型的分化细胞。,4.嵌合体的形成 利用桑葚胚聚合法和囊胚注射法将ES细胞注射到受体胚胎中，经胚胎移植产生嵌合体动物。嵌合体动物可以通过皮毛颜色、蛋白质、同工酶等进行检测。,第三节ES/EG细胞体外诱导分化,第一节ES/EG细胞维持未分化的分子

25、机制第二节ES细胞体外分化的基本原理第三节ES细胞体外分化的基本原理第四节 ES细胞技术的应用,ES/EG细胞维持未分化的分子机制,一、LIF/STAT3通路,二、Oct-4,LIF/STAT3通路,几个重要的概念LIF（leukemia inhibiting factor）：一种多功能细胞因子，在体外具有抑制胚胎干细胞自主分化的能力，并能够促进8细胞期以后的桑葚胚至着床前胚胎的发育，促进滋胚层细胞增殖和内细胞团生长。STAT3(single transducer and activator of transcrption),LIF/STAT3通路,LIF受体（LIFR）:广泛分布在体细胞上，

26、是一种分子质量为250kDa的糖蛋白，由LIFRB和gp130组成。gp130:一种跨膜糖蛋白，分子质量为130kDa,与LIFRB结合后，可使LIFR由低亲和力向高亲和力转换。,LIF/STAT3通路机制,LIF与LIFR结合后，可激活结合于gp130胞内近膜部分的JKA激酶，活化的JKA激酶催化gp130胞质区的酪氨酸酸化，进而激活转录因子STAT，活化STAT形成同源二聚体并移向核内，与核内特异的靶细胞基因位点结合并激活STAT1与STAT3，STAT3是维持ES细胞不分化状态的决定性因子，被激活后就足以抑制ES细胞的分化。,Oct-4在维持细胞分化中的作用,Oct-4基因表达上调2倍可

27、使ES细胞分化为原始的内胚层细胞，表达程度不变可维持ES细胞未分化状态，表达下调可使ES细胞分化为滋养层细胞。Oct-4基因的表达是维持ES细胞维持未分化状态的必要条件，但不是充分条件，还需LIF等其他因子的协同作用。,在ES/EG细胞中，LIF/STAT3转录和转录因子Oct-3/4对维持ES细胞的未分化起关键作用。LIF等因子通过复合物gp130磷酸化效应分子的酪氨酸残基，将信息传至细胞核内相应的靶基因上而使细胞处于高度增值状态，同时转录因子Oct-3/4及相关基因的表达也可以使ES细胞维持未分化状态。,总结：,ES细胞体外分化的基本原理,ES细胞在体外的培养过程中能够在有饲养层细胞或分化

28、抑制因子（DIA），白血病抑制因子（LIF)等存在的条件下维持其未分化的状态，保持发育全能性，可以无限增 殖。,但一旦出去饲养层细胞，除去这些抑制分化因子，或者添加一些诱导分化因子（维甲酸RA，神经生长因子NGF等，就会向各类可能的细胞发生定向分化。,对小鼠ES细胞进行各种方式的诱导分化，可以获得神经细胞,造血祖细胞，成骨细胞，干细胞，角质细胞，胰岛细胞和滋养细胞等各种细胞。,神经细胞,造血祖细胞,造血干细胞在一定微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称造血祖细（hemato poietic progenitor cells HPCs）。它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞

29、，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞（committed stem cell）。,成骨细胞,成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。,骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。,肝细胞,肝脏是由肝细胞组成，肝细胞极小，肉眼看不到，必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞，50个肝细胞组成一个肝小叶，因此人肝的肝小叶总数约有50万个。,角质细胞

30、(Keratinocytes)是已分化的表皮细胞,角质细胞,胰岛细胞,滋养细胞 trophocyte,其他名称：滋卵细胞(nurse cell)定义：卵巢中来自卵原细胞的滋养细胞，提供卵发育所需物质,ES细胞体外分化的模式,（一）自发分化（二）诱导分化（三）基因调控分化,（一）自发分化,自发分化是指ES/EG细胞在体外呈单细胞悬浮培养时，会形成由多种类型细胞组合的类胚体，再加入生长因子干预后能够增加某一类型细胞的相对数量。如形成有搏动功能的心肌细胞，这些细胞具有胎儿心肌细胞的特性。,（二）诱导分化,诱导分化是将ES细胞与不同类型的细胞共培养或添加相应的生长因子能够诱导干细胞发生向单一类型细胞的

31、定向分化。,例如：1.骨髓基质细胞或OP9细胞可诱导ES细胞向造血干细胞分化 2.PA6细胞可促使ES细胞向神经细胞分化3.贴壁生长的ES细胞在DMSO和丁酸钠依次诱导下可以形成干细胞,OP9细胞能支持来源于胚胎的干细胞发育成为造血淋巴细胞,DMSO(dimethyl sulfoxide）二甲基亚砜是一种氢键破坏剂,（三）基因调控分化,基因调控分化是利用ES细胞的体外遗传可操作性，通过强化或抑制某些基因的表达来形成单一谱系所特有的基因表达方式，结合培养条件和诱导因子的作用定向诱导ES细胞的分化。,例如将TAT PDX1融合蛋白转入hES细胞，激活下游靶基因的表达，促进了肝细胞胰岛素的分泌，有助

32、于干细胞向胰岛细胞的分化,TAT-PDX1融合蛋白诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛细胞分化PDX1是决定胰岛细胞功能的关键因子,应用穿膜蛋白TAT将PDX1蛋白导入细胞内,三、体外诱导分化的方法,基因外诱导基因修饰,（一）基因外诱导,基因外诱导即在细胞水平上对ES细胞进行诱导分化，包括诱导剂法、序贯诱导法、还有目前尚有争议的特殊诱导方法。这些方法各有优势，因其操作相对简单、对实验要求不高，为大多数实验者采用。,1.诱导剂法,机制：通过ES细胞结合于RA受体，后者与目的基因的DNA结合域（RA反应元件,RARE）结合，刺激神经相关基因并抑制中胚层相关基因的转录，通过激活卵泡抑素，抑制了BMP的表达，

33、从而促进神经的分化。,诱导剂：,视黄酸(retinal acid,RA)是一种脂溶性的小分子物质(300 ku),属于 Vit A的衍生物 类黄维生素 A(Retinoids),是细胞生长、分化增殖和程序性凋亡的关键调节因子,参与胚胎发育、组织分化、肿瘤细胞的生长等过程。,1.诱导剂法,方法:向未分化的ES细胞培养液中添加一定量的RA，或者在已分化的ES细胞中直接添加RA，就可以获得大量的神经细胞优点：试验所需时间短、成本低，是使用广泛的神经诱导方式,八日诱导程序（经典RA诱导法）,将未分化的鼠ES细胞（mES）用细吸管吹散，在悬浮液中培养四天形成类胚体（EB）在想培养液中添加0.5mol的全

34、反式维甲酸（ATRA），培养后有38的细胞形成神经元样细胞。一般，较高浓度RA作用时间较长时能更有效地诱导ES细胞向神经元样细胞分化,序贯诱导法,序贯诱导法是模仿体内胚胎细胞生长和分化的环境，按ES细胞生长阶段逐步改变培养液成分及血清浓度，添加生长因子和神经营养因子等，诱导ES细胞向神经细胞定向分化优点：操作简单、细胞毒性小，而且产生的神经细胞纯度较高,五步序贯诱导法,1.扩增未分化的胚胎干细胞2.去除有丝分裂素或分化抑制剂，悬浮生长，逐渐形成类似体内发育的胚体EB,3.去除生长因子，选择巢蛋白阳性细胞4.使用神经细胞培养液，添加生长激素、神经营养因子，扩增神经前体细胞5.利用促神经元存活因子

35、（SPF）诱导并维持神经元成熟,直接分化法,机制：可能是通过神经分化内定模式(default model)发生，即外胚层细胞可在无外界信号诱导下自发分化为神经细胞方法：将ES细胞在饲养层细胞上高密度延长培养，再用神经细胞培养液培养，ES细胞能自发分化为神经样细胞，然后使用无血清神经培养液ES细胞过度生长，在细胞集落中央可获得高纯度的原始神经上皮，进而获得大量神经细胞。,4 其他诱导方法,基质细胞饲养层诱导及生长激素和神经营养因子向神经细胞诱导分化，将ES细胞与各种基质细胞共培养，也能分化为特定类型的细胞。,（二）基因修饰,基因修饰已被应用于对哺乳动物ES细胞的定向诱导，它也是研究干细胞分化或增

36、殖机理的重要手段之一。尽管基因修饰存在致癌性、不稳定性及其它不可预见的危险性，但它的可行性已经得到了证明。,方法一,将一个特异性基因通过病毒载体转染入ES细胞，即可得到高纯度的特定类型细胞。如nestin是一种常用的神经前体细胞标志蛋白，将它与报道基因增强型绿色荧光蛋白（eGFP）共同转染ES细胞，经过筛选纯化得到神经前体细胞。,方法二：,向ES细胞导入一段增殖基因，该基因表达后调控ES细胞其他基因的表达，促进其分化，从而实现ES细胞的定向分化。如：将促多巴胺能神经元生成的转录因子Nurrl通过质粒稳定转入mES细胞系，建立NurrlES细胞系，再经过五步序贯诱导法，得到50多巴胺神经元。,二

37、、优点及存在的问题,基因修饰使人们能够快速、方便的直接进行细胞诱导，但如何有效地提高基因转染率以及探讨各个基因在ES细胞中的调控作用仍处于初步研究阶段，而ES细胞的基因治疗也仅应用于实验动物模型。,第四节 ES/EG细胞技术的应用,1建立哺乳动物发育的体外模型2生产转基因动物3基因和细胞治疗4器官培养,1建立哺乳动物发育的体外模型,ES细胞具有发育成完整动物体的能力，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的试验材料,1建立哺乳动物发育的体外模型,ES细胞悬浮生长时可得到类胚体成为早期胚胎发育分化的体外模型研究特定类型细胞分化及某些前体细胞起源的模型利用同源重组或基因打靶技术使ES细胞某些基

38、因发生突变，以对胚胎发育中起作用的基因进行分析,利用ES细胞生产转基因动物,与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基因动物方面表现其独特的优势,（1）可提高转基因动物的效率（2）增殖迅速（3）体外操作技术相对容易,能克服插入失活和特殊内源性基因失活等缺点（4）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快了动物群体遗传变异程度；（5）可以进行定向变异和育种，（6）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。,3基因和细胞治疗,细胞治疗是指用遗传工程改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到治愈和控制疾病的目的。目前基因治疗中存在的问题(1)导入基因

39、的整合和表达难以控制(2)用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代等,ES细胞的优越性：具自我更新能力,经遗传操作后仍能稳定地在体外增殖传代。以ES细胞为载体，经体外定向改造，使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行，容易获得稳定、满意的转基因ES细胞系用于治疗神经性疾病、心肌缺损、风湿性关节炎、糖尿病等,用骨髓干细胞治疗糖尿病,骨髓干细胞（绿色）诱导白鼠胰腺（红色）中胰岛素的再生。50微米尺度。,4器官培养,可以利用存在于健康组织的干细胞修复或再生受损组织,利用ES细胞培养出的肺,这是第一次利用从患者的骨髓里提取的成熟干细胞培养新组织或者器官，用于移植,利用ES细胞培养出的心脏,研究人员利用干细胞培育出血管细胞和心肌组织细胞，并将两者相混合，由此产生的“补丁”心肌组织就拥有了丰富的血管网络，可以保证血液的正常输送，从而得以生存并拥有充足的营养,利用ES细胞培养出可植入的乳房组织,利用自体脂肪干细胞来生成植入物，以替代目前广泛使用的硅胶假体和盐水假体。,Thank you!,