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1、第三章 离心分离技术,离心分离技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子的不同，而使物质分离的技术。,离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。,第一节 基本原理,离心力（centrifugal force，Fc）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到的离心作用力“Fc”由下式定义：Fc=ma=m2 r a：粒子旋转的加速度，m：沉降粒子的有效质量，：粒子旋转的角速度，
2、r：粒子的旋转半径(cm)。,相对离心力（relative centrifugal force，RCF）:由于在转速相同的情况下，离心力会随离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字g”表示离心力，RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转子每分钟的转数（revolutions per minute,简写成r/min,或rpm）。,2,2,一般在低速离心时（转速小于5000 r/min），离心力的大小常用r/min来表示，而超速离心时则用g或g来表示。由于离心
3、管中从管口到旋转中心的距离是不同的，所以在同样转速时，管口和管底所受到的离心力也有差别。科技文献中离心力的数据通常是指其平均（RCFav），即离心管中点的离心力。,旋转轴,340,rmin,rav,rmax,沉降系数（sedimentation coefficient，s）：根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义为在单位离心场中颗粒沉降的速度。若用2n/60表示，则,X1：离心前粒子到旋转轴的距离。X2：离心后粒子到旋转轴的距离。S：一般在10-13秒左右，故把沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位，简写S，量纲为秒。例如，动物细胞的核糖体沉降系数等于80S，它的含义就是：
4、8010-13 s。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用离心技术将他们彼此分开。,沉降速度（sedimentation velocity）：对于球形颗粒 Fc=(1/6)d3(pm)2X Ff=3dv 当Fc=Ff时(1/6)d3(pm)2X=3dv v=(1/18)d2(pm)2X Fc：离心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直径；：流体介质的粘度；P：粒子的密度；m：介质的密度；v：粒子移动的速度从上式可知，粒子的沉降速度与粒子直径的平方、粒子的密度和介质密度之差成正比；离心力场增大，粒子的沉降速度也增加。,将此式代入上项沉降系数公式中，则S的表达式
5、也可表示为：当pm，则S0，粒子顺着离心场方向沉降。当pm，则 S0，粒子到达某一位置后达到平衡。当Pm，则S0，粒子逆着离心场方向上浮。,5.沉降系数与物质相对分子质量:由沉降系数根据Svedberg 公式可以计算出物质的相对分子质量：Mr=RTS20,w/D20,w(1-)Mr：相对分子质量D20,w：以20的水为介质时颗粒的扩散系数 R:气体常数 T：绝对温度 S20,w：以20的水为介质时颗粒的沉降系数：偏比容，等于溶质粒子密度的倒数：溶剂密度,6.沉降时间（sedimentation time，Ts）:在实际工作中，常常需要在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来，这就必
6、须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间。根据沉降系数（S）式可得,积分得 X2:离心转轴至离心管底内壁的距离；X1:离心转轴至样品溶液面之间的距离，将（t2t1）用Ts表示：其中的(lnXmax lnXmin)/2为一常数，称k常数或k值。,7.K值（k factor）:K值是用来描述在一个转子中，将粒子沉降到离心管底的效率。也就是溶液达到澄清的一个指数，所以也叫“cleaning factor”。原则上，K值愈小，粒子沉降到离心管底需要的时间愈短。,通常，离心机的转子说明书中提供的K值，是在最大转速下所计算出来的数值。若未达到最大转速，可用下式计
7、算K值：利用此公式预估的离心时间，对水平式转子最适合；对固定角式转子而言，实际时间将比预估的时间短一些。,第二节离心机的主要构造和类型,离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和相对分子质量等。分析性离心机都是超速离心机。,1.制备性离心机:（1）低速离心机:最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫
8、升至几升，分离形式是固液沉降分离。可用水平转头，角度转头，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。,（2）高速离心机：最大转速为20000-25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，通常配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消
9、除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0-40oC，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、蛋白质的硫酸铵沉淀物和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。,（3）超速离心机：大于30103 r/min，最大离心力600,000g，有驱动和速度控制系统，温度控制系统，真空系统（减少摩擦）。新式的有微处理机（按编定程序运转，自动计算速度和时间）。有40多种不同容量和性能的转头给用户选择。离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡
10、允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。,角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4-12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20-40度之间，角度越大分离效果越好。优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管壁，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”。壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。,2
11、.转头,角式转头,荡平式转头：这种转头有4或6个自由活动的吊桶（离心套管），当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心。优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。,区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通
12、过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。,沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。,垂直转头：其离心管垂直放置，样品颗粒的沉降距离短，离心所需时间也短，适用于密度梯度区带离心，离心开始时和结束时液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。,连续流动转头：可用于大量培养液或提取
13、液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。,3.离心管离心管主要用塑料和不锈钢制成：塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。,塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：防止样品外
14、泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。防止样品挥发。支持离心管，防止离心管变形。,4.分析性离心机 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。利用特殊配置的数据处理机自动计算s(沉降系数)和Mr。主要用于生物大分子的相对分子质量测定，估价样品纯度和检测生物大分子构象的变化等。主要产品有美国Beckman公司的Model E及日本日立公司的282型。,分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。转头通过一个有柔性的轴联接到高速的驱动装置上，转头在低温和真空的腔室中旋转，转头上有2-6个装离心杯的小室，离
15、心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”，随着沉降的不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。,分析性超速离心机的主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例，测定
16、生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。,5.离心机的系统及其功能,(1)驱动系统:提供离心机动力(2)制冷系统:冷却离心腔(3)真空系统:减少离心室中的空气与转头产生的摩擦热(4)光学系统:识别转头 测速-利用转头底黑白相间的花边进行扫描，经计算机处理获得离心速度 沉降状态检测,（5）控制系统:离心机的指挥中心 速度控制 温度控制 真空度控制（6）润滑系统（7）防护系统,第三节离心分离方法的选择,离心分离的方法可分为三类差速离心,密度梯度离心,等密度离心,1、差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。操作时，采用均匀的悬浮液进行离
17、心，选择好离心力和离心时间，使大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分离较小的颗粒。如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。差速离心所得到的沉降物含有较多杂质，需经过重新悬浮和再离心若干次，才能获得较纯的分离产物。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差。,600g,3 min.上清,6000g,8 min.上清,40000g.30 min.上清,100000g.90 min.上清,沉淀：细胞核,沉淀：线粒体，叶绿体，溶酶体，过氧化酶体,沉淀：细胞质膜，高尔基体和内质网膜的碎片,沉淀：核糖体亚基,细胞液,差异（速）离心法,2密度梯度离心 密
18、度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的组分得以分离的一种区带分离方法。密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度。常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其梯度范围是：蔗糖浓度560，密度1.021.30g/cm3。密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓度的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底，浓度越高，形成阶梯梯度。,离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带，各区带内的颗粒较均一，分离
19、效果较好。在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改变。随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增大离心力而缩短离心时间，可以减少区带扩宽。,3.等密度离心：密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在预先制备好的梯度介质溶液顶上，或先与梯度液混合后装入离心管，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。离心时，样品的低密度的颗粒向上浮起，高密度的颗粒向下沉降，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成不同的区带。,当介质的密度大于粒子的密度，即mP时粒子上浮；在
20、Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个与它本身的密度相等的位置，即Pm，此时dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。但颗粒的大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。,等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7
21、g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。收集区带的方法有许多种:a:用注射器和滴管由离心管上部吸出。b:用针刺穿离心管底部滴出。c:用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。d:用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。,梯度溶液的制备:梯度材料的选择原则 作为一种理想的梯度材料应具备以下几点：与被分离的生物材料不发生反应，即完全惰性，且易与所分离的生物粒子分开。可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH变化较小。不会对离心设备发生腐蚀作用。容易纯化，价
22、格便宜或容易回收。浓度便于测定，如具有折光率。对于超速离心分析工作来说，它的物理性质、热力学性质应该是已知的。,上述条件是理想条件，完全符合每种性能的梯度材料几乎是没有的。基本上符合上述原则的梯度材料有：糖类：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1.33g/ml，且由于价格低容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗透压，不宜用于细胞的分离。聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400，也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡萄
23、糖胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞，包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。,无机盐类：CsCl（氯化铯）、RbCl（氯化铷）、NaCl、KBr等。氯化铯：是一种离子性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g/ml。由于它是重金属盐类，在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，但价格较高。卤化盐类：KBr和NaCl可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。有机碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。,硅溶胶：如Percoll：是商品名，
24、它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮（PVP），渗透压低，对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下仍是稳定的，其粘度高，且在酸性pH和高离子强度下不稳定。可用于细胞、细胞器和病毒的分离。蛋白质：如牛血清白蛋白。重水。非水溶性有机物：如氟代碳等。,第四节 离心条件的确定,离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间，此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。,1离心力物质颗粒在离心场中所受到的离心力(Fc)的大小，决定于颗粒的质量(m)和离心加速度(ac)：Fc=mac ac=2r：转子的角
25、速度(rads)；r：旋转半径，即颗粒到旋转轴中心的距离(cm)，若转速以惯用的每分钟转数(rmin)来表示，则=2n/60,代入上式，得到：c=2r=42n2r/3600式中 n：转子每分钟转数(rmin)。在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数表示，如4000 rmin；而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离心力来表示，如：65，000g。,相对离心力：是指颗粒所受的离心力与地心引力(重力)之比。即 RCF=Fc/Fg=42n2r/（3600g）将有关数字代入上式，化简为：RCF=1.1210-5 n2rg式中 RCF：相对离心力(g)；n：转子每分钟转数(rmin)；
26、r：旋转半径(cm)；g：重力加速度，9806 cms2,由此可见，离心力的大小与转速的平方及与旋转半径成正比。在转速一定的条件下，颗粒离轴心越远，其所受的离心力越大。在离心过程中，随着颗粒在离心管中移动，其所受的离心力也随着变化。在实际工作中，离心力的数据是指其平均值。即是指在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。,RCF=1.1210-5 n2rg,2离心时间,离心时间的概念依据离心方法的不同而有所差别。对于差速离心来说，是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。对等密度梯度离心而言，离心时间是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。密度梯度离心的时间则是指形成界限分明的区带的时间。密度梯度离心和等密度梯
27、度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验来确定。差速离心所需的沉降时间可通过计算求得。,颗粒的沉降时间是指颗粒从离心样品液液面完全沉降到离心管底所需的时间，又称澄清时间。沉降时间取决于颗粒沉降速度和沉降距离。对于已知沉降系数的颗粒，其沉降时间可由下列公式计算：t=（1/s）（lnr2一lnr1）/2式中t：沉降时间(s)；S：颗粒的沉降系数(110-13 S)；：转子角速度(rads)；rl，r2：分别为旋转轴中心到样品液液面和离心管底的距离(cm)。,上式中括号部分对特定转子为一常数，称转子效率因子或K值。即 K=（lnr2一lnr1）/2=St转子的效率因子K与转子的
28、半径和转速有关。生产厂家已在转子出厂时标出了最大转速时的K值，由此可以根据2K1=2K2算出其他转速时的K值。对于具有某一沉降系数S的颗粒来说，K值越小，其沉降时间越短，转子的使用效率就越高。,在离心机及其转子选定后，rl和r2不变。对于某种物质颗粒(S确定)的沉降起决定作用的是转子的转速以及沉降时间t。操作时可采用较低的转速，离心较长的时间；或采用较高的转速，离心较短的时间，而得到相同的2t。例如：用10 000 rmin离心10 min，计算得 2t=(2n/60)2t=6.5785108(S-1)如果用5000 rmin的转速离心40 min，2t值为6.5766108(S-1)，两者基
29、本相等。,.离心操作的注意事项,高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。超速冷冻离心机:未经过培训和考核者不能使用。其它普通离心机：按照操作要求进行。,1.使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。2.离心前必须仔细检查转头各孔内有无异
30、物。3.若要在低于室温的温度下离心时,转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。4.离心开始前必须检查转子盖是否旋好，并且盖好机盖。,5.装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。6.每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干。转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护。,7.离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。8.每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。9.离心时不准开盖，不准用手停止转头。,10.使用完机器后不要马上盖上机盖，应等离心室内壁化霜，清理干净后，再盖上机盖。11.离心机移动后,最好4个小时后再使用。检查离心机电源插座能否负担离心机的使用功率(250V,10A)。,
