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1、项目二、核酸生产任务1、核酸制备方案生物制药1111樊贝贝,目录,核酸知识复习核酸类药物特性动物肝脏DNA的提取酵母RNA的提取核酸类药物检测,核酸知识复习,核糖（核糖脱氧核糖）核苷 嘌呤（腺嘌呤、鸟嘌呤）碱基 核酸 核苷酸 嘧啶（胞、尿、胸腺嘧啶）（DNA、RNA）磷酸DNA和RNA是存在于细胞中的正常成分。DNA主要存在于细胞核中，少量（2%）存在于线粒体和叶绿体中；RNA主要存在于细胞质中，少量（10%）存在于核仁、核浆和染色体中。核酸的含量与细胞大小无关，以生长旺盛的组织细胞中含量较多，如动物胰脏、脾脏、胸腺，植物的茎尖、根尖及各种分生组织等。,核酸类药物特性,又称核苷酸类药物。由某些
2、动物、微生物的细胞中提取出的核酸(包括核苷酸和脱氧核苷酸)，或者用人工合成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸和脱氧核苷酸结构)同时又具有一定药理作用的物质，称为核酸药物或核酸类生化药物。广义的核酸药物可包括核苷酸药物、核苷药物及含有不同碱基化合物的药物。核酸药物具有多种药理作用，,按其作用特点可分为：(1)抗病毒剂，代表药物有三氮唑核苷、无环鸟苷和6可糖腺苷等，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒及其他病毒；(2)抗肿瘤剂，代表药物有用于治疗消化道癌的氟尿嘧啶以及用于治疗各类急性白血病的阿糖胞苷,(3)干扰素诱导剂，代表药物为聚肌胞，临床上用于抗肝炎病毒、疱疹病毒等；(4)免疫增强剂，主要用于抗病毒及
3、抗肿瘤的辅助治疗；(5)供能剂，用于肝炎、心脏病等多种疾病的辅助治疗。药用腺苷三磷酸(ATP)原粉可从酵母RNA为原料制备，也可通过人工合成及发酵生产。,核酸类药物,动物肝脏DNA的提取,目的：了解分离提取DNA的一般原理，掌握从动物肝脏中提取DNA的方法,原理,在浓氯化钠（1-2molL-I)溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14molL-1）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。,将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸钠）处理，DNA(或RN
4、A)即与蛋白质分开，可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加EDTA（ethy-lenediamine tetraceticacid，乙二胺四乙酸）。,器材及试剂,器材新鲜猪肝（一次用不完一定要冷冻保存）匀浆器离心机5000rmin-1量筒 50ml（1）、10ml（1）水浴锅纱布真空干燥器,试剂5molL-1NaCl溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至1000ml。0.14molL-1NaCl-0.0015molL-1EDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸馏水中
5、，稀释至1000ml。25%SDS溶液：溶于25g十二烷磺酸钠于100ml45%乙醇。0.015molL-1NaCl-0.0015molL-1柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。,氯仿异戊（丙）醇混合液：氯仿：异戊（丙）醇=24:1（v/v）1.5molL-1NaCl-0.15molL-1柠檬酸三钠溶液：氯化钠82.8g及柠檬酸三钠34.1g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。3molL-1乙酸钠-0.001molL-1EDTA-Na溶液：称取乙酸钠408g、EDTA-Na0.372g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。70%乙醇、80%乙醇、95
6、%乙醇、无水乙醇。,工艺路线,具体操作方法,1.取猪肝2030g，用适量0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入3050ml0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA溶液，置匀浆器或研钵中研磨，研磨一定要充分，待研成糊状后，用单层纱布滤去残渣，将滤液离心10分钟（4000rmin-1）弃去上清液，沉淀用0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA溶液洗23次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。,2.向上述沉淀物加入0.14molL-1NaCl-0.10molL-1EDTA 溶液，使总体积为37ml，然后滴加25%SDS溶液3
7、ml，边加边搅拌。加毕，至60水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。3.加入5molL-1NaCl溶液10ml。是NaCl最终浓度达到1molL-1，搅拌10分钟，加入月一辈体积的氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，静置分层，取上、中两层液离心10分钟（4000rmin-1）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.52倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。,4.将DNA粗品置于27ml0.015molL-1NaCl-0.0015molL-1柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5molL-1Na
8、Cl-0.15molL-1柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，离心（4000rmin-1，10分钟），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。,5.将上步所得沉淀溶于27ml0.015molL-1NaCl-0.0015molL-1柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用75%、80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。保存待用。,酵母RNA的提取,目的 学习稀碱法提取RNA的技术原理 组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上
9、层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。,酵母,器材与试剂,器材干酵母粉、鲜酵母、PH试纸、天平、烧杯、量筒、抽滤瓶，吸管、布氏漏斗、离心机试剂0.2NaoH溶液、2gNaoH溶于水并稀释至100mol。乙酸、95%乙醇、无水乙醚。氨水、10%的硫酸溶液、5%的硝酸银溶液、苔黑酚三氯化铁试剂,工艺路线,操作步骤,1、RNA的提取：置4g干酵母粉于100mL的烧杯中，加入0.2%的氢氧化钠溶液40mL2、沸水浴加热30分钟，不停搅拌3、加入乙酸数滴，使提取液呈酸性4、离心1015分钟（4000rmin-1）5、取上
10、清液，加95%乙醇30mol，边加边搅拌，加毕，静置，待完全沉淀，过滤。6、滤渣先用95%乙醇洗2次（每次约10ml)，继续用无水乙醚洗2次，洗涤时可用细棒小心搅拌沉淀。乙醚虑干后，滤渣即为粗RNA,可作鉴定。,核酸类药物检测,1、DNA含量测定DNA是磷酸和戊糖通过磷酸二酯键形成的长链，所以磷酸或戊糖的量正比例于DNA的量，可通过测定磷酸或戊糖的量来测定DNA的量，前者称为定磷法，后者称为定糖法。（1）定磷法磷酸与钼酸反应生成磷钼酸，再转变为钼蓝，吸收峰在660nm。（2）定糖法二苯胺法酸性条件下，DNA与二苯胺共热，生成蓝色化合物，吸收峰595nm。,2、RNA含量测定（1）定磷法660nm；（2）定糖法地衣二酚（苔黑酚）法。盐酸水解RNA，使核糖游离出来，并生成糠醛，与地衣二酚反应呈蓝绿色，在670nm处有最大吸收峰。3、核苷酸、核苷含量的测定紫外分光光度法它们都有特殊的紫外吸收曲线，选取合适的波长，可以根据其吸收值测定核苷、核苷酸的含量。,
