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1、2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,1,第三章 食品微生物检验的基本程序,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,2,本章的主要内容,一、食品微生物检验的一般步骤二、检验前的准备三、样品的采集四、样品的送检五、样品的处理方法六、致病菌检验参考菌群的选择七、样品的检验八、检验结果的报告,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,3,一、食品微生物检验的一般步骤,样品采集,样品处理,样品保存,选择参考菌群,检验前的准备,菌落总数,大肠菌群,致病菌,分离培养,分离培养,增菌,纯化,染色镜检,生化试验,血清学试验,动物试验,结果报告,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,4,二、检
2、验前的准备工作,建立一个无菌取样的分析清单，按清单准备工具、容器、设施（衣服、发网等）；盛样品的容器应当被预先标识，如样品号、取样日期、取样人等；检查所有取样设施、工具和容器的灭菌日期、灭菌时间，并做好标识；准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择必培养基；注意干冰或湿冰的准备及保存。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,5,三、食品检验样品的采集,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,6,（一）样品的种类,大样：整批检验中样：采样员从大样各部分取得的混合样（250克）小样：检验员用来检验的样品（一般为25克）。表面污染：50cm2（5cm 210处）罐头食品：罐/批、班
3、次 一般每个品种3罐，可以以每配料罐或灭菌锅为一批。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,7,（二）采样的原则,代表采样当时的及样品整体的情况；考虑到各种影响样品质量的因素，防止样品受到外源性污染；防止样品变质 防止食品中固有微生物的数量和生长能力发生变化。不得加入防腐剂、固定剂等。样品采集和现场测定必须有二人以上参加。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,8,（三）取样方案,进出口贸易合同对食品抽样量有明确规定的，按合同规定抽样。合同没有具体抽样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定抽样方案。参照GB/T 4789.1-2010中华人民共和国国家
4、标准 食品卫生微生物学检验 总则之采样数量。国际上最为流行的抽样方案为The International Commission on Microbiological Specification for Foods推荐的抽样方案和随机抽样方案。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,9,国际食品微生物专业委员会(ICMSF)推荐的抽样方案,采样设想及其基本方法可充分混合的物体，用于分析的样品可能代表所抽“一批”（lot）样品的真实情况，采样时可以充分混匀后随即采样；不可充分混合的物体，在“多批”（Lots或“batchers”）食品的情况下就不能如此抽样，因为“一批”容易包含在微生物的质量
5、上差异很大的多个单元。因此在选择抽样方案之前，必须考虑诸多因素（ICMSF，1986），包括：检验目的产品及被抽样品的性质分析方法,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,10,国际食品微生物专业委员会(ICMSF)推荐的抽样方案,采样基本原则（1）各种微生物本身对人的危害程度各有不同。（2）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：降低危害度；危害度未变；增加危害度。根据（1）（2）的情况来设定抽样方案并规定其不同采样数。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,11,几个字母代号,n：系指一批产品采样个数。c：系指该批产品的检样菌数中，超过限量的检样数，即结果超过合格菌数限量的最大允
6、许数。m：系指合格菌数限量，将可接受与不可接受的数量区别开。M：系指附加条件，判定为合格的菌数限量，表示边缘的可接受数与边缘的不可接受数之间的界限。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,12,ICMSF的二级抽样方案,二级法只设有n、及m值以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。以生食海产品鱼为例 n=5，c=0，m=102，（n=5即抽样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有超过m值的检样，此批货物为合格品)。在中等或严重危害的情况下使用二级抽样方案,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,13,ICMSF的三级抽样方案,三级法有n、c
7、、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。设有微生物标准m及M值两个限量，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌数标准 n=5，c=3，m=102CFU/g，M=103CFU/g，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果，允许3个检样的菌数是在mM值之间，如果有3个以上检样的菌数是在mM值之间或一个检样菌数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。对健康危害低的情况下建议使用三级抽样方案,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,14,ICMSF的随机抽样方案,随机抽样，就
8、是保证在抽取样本过程中，排除一切主观意向，使批中的每个单位产品都有同等被抽区的机会的一种抽样方法。在现场抽样时，可利用随机抽样表进行随机抽样。随机抽样表系用计算机随机编制而成，包括一万个数字。其使用方法如下：a先将一批产品的各单位产品（如箱、包、盒等）按顺序编号。如将一批600包的产品编为1、2600。b.随意在表上点出一个数。c.根据单位产品编号的位数进行抽样。重复抽样，直到完成应抽样品件数为止。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,15,（六）食品微生物检验采样方法,采样原则：能采取完整包装的样品就不拆开取样，必须拆开包装取样的应按无菌操作进行取样.,2023/3/4,华南农业大学
9、食品学院王丽,16,1、直接食用的小包装食品,直到检验前不要开封，以防污染,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,17,2、统装或大容器包装的液体食品,抽样前摇动均质，取样不超过其容量的四分之三，测温，记录，冷却（0-4），取样检测前再混匀一次，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,18,3、统装或大容器包装固体和半固体食品,大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。（肉类、鱼类或类似食品要将表面样品和深层样品分开保存，防止交叉污染）,20
10、23/3/4,华南农业大学食品学院王丽,19,4、统装或大容器包装的冷冻食品,取样时可以用锥子、木钻等获取深层样品。样品一旦融化，不可使其再冻，保持冷却即可。大包装小块冷冻食品按小块个体采取；大块冷冻食品可用无菌刀从不同部位削取或用无菌手锯从冻块上锯取样品，放入无菌容器。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,20,5、生产工序监测采样,车间用水：采用带有防尘磨口瓶塞的广口瓶。取样时应先用流水处理出水口，再消毒出水口，才能取样；若怀疑出水口的卫生状况，可以连带取样。取样时避免用手接触水样或取样瓶内部。对于用氯气处理过的水，取样后在每100mL水样中加入0.1mL的2硫代硫酸钠(?)。,2
11、023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,21,表面取样：通过惰性载体将表面样品上的微生物转移到合适的培养基中进行微生物检测。适应于菌体数量较少的样品。载体包括清水、拭子、胶带等，其它有琼脂肠、影印盘、触片法、表面切片法等.,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,22,工作台：将经灭菌的内径为5cm5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,23,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,24,空气监测：采样时，将含营养琼脂的平皿（直
12、径9cm）置采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平皿在空气中暴露5min。,平皿,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,25,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,26,生产工序监测采样,工人手 被检人五指并拢，用一浸湿生理盐水的棉签在右手指曲面，从指尖到指端来回涂擦10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。,每只手表面细菌菌落总数（cfu/只手）平板上平均细菌菌落数10,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,27,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,28,6、采样标签的填写,对采样前后的大、中、小样均要进行标识，注明：编号、品名
13、、来源、批号、数量、时间、采样人姓名、采样条件，并填写记录表格。盛样容器必须有和样品一致的标记，并确保标记牢固并防水。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,29,采样单 样品编号：产品名称（商品名）_规格型号_注册商标_ 生产厂家_ 通讯地址_邮政编码 受检地点_ 通讯地址_ 邮政编码 采样地点_ 采样日期_采样基数 _ 生产日期_ 批号_ 产品依据标准_ 有效成分及含量_ 检验目地_检测项目_ 采样人仔细阅读以下句子，然后签字我认真负责地填写了该样品采样单，承认以上填写的合法性，被该采亲单位所证实的样品系按照采样方法取得的，该样品具有代表性、真实性和公正性。代表单位（章）代表单位（章
14、）签字 签字 日期年月日 日期 年月日 备注,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,30,四、样品的送检要求,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,31,1、样品的运送 注意防污染、防散漏、防变质,防护包装：液体防漏、冷冻食品防融，一般用减震材料（泡沫材料）和隔热箱（内装干冰以维持0）；尽快送检：3小时；冷冻食品应保持冷冻状态，非冷冻食品保持15；填写送检单，内容与标识单相似，有运送人签字。不能由专人运送的样品，可以托运，但要确保安全。中毒样品或致病菌样品必须专人、专车运送。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,32,2、检样的接收,样品的接收 1、查对样品：根据送检单对照
15、样品，要求样、单一致；2、填表登记：内容与标识相似，注明接收日期等；一般先微检，后化检。3、分类保藏：冷藏、冷冻或室温。样品的拒收 样品数量、状态、外形或包装等与送检单不符。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,33,3、样品的保存,样品到实验室后应在36h内检验（贝类是6h）。进行必要和清晰的标识：样品名称、样品描述、样品批号、企业名称和地址、取样人、时间、地点、温度和测试目的。样品在保存过程中采用适当的方法，取保样品和微生物的状态，仍能代表取样时的特性。（特别需要注意温度、pH值、氧气等条件变化）对样品的贮存过程应有记录。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,34,五、样品
16、的处理方法,是指对采取的样品的分取、粉碎及混匀等过程，以保证样品的均匀性，在检验时能具有代表性。液体样品固体样品冷冻样品,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,35,(一)液体样品的处理,1.瓶装液体样品的处理2.盒装或软塑料包装样品的处理3.半固体或粘性液体食品,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,36,1.瓶装液体样品的处理,先摇匀-表面消毒-用无菌工具开罐-吸样（2.5cm深度）用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，接着用石炭酸或来苏尔消毒后的纱布盖好，再用灭菌开瓶器将盖启开；含有二氧化碳的样品可倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25
17、mL检验；酸性饮料：pH4.5 用灭菌的10%Na2CO3调至中性。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,37,2.盒装或软塑料包装样品的处理,将其开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪子剪开包装，覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布在剪开部分，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,38,3.半固体或粘性液体食品,融化（45水浴），小于15min，取样。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,39,（二）固体样品的处理,捣碎均质法剪碎振摇法研磨法整粒振摇法胃蠕动均质法,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,4
18、0,1.捣碎均质法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g放入带225mL稀释液的无菌均质杯中，800010000r/min均质12min即可。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,41,2.剪碎振摇法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样进一步剪碎，放入带225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,42,3.研磨法,将中样(100g)剪碎或搅拌混匀，从中取25g检样放入无菌钵中充分研磨后，再放入带有225mL无菌稀释液的稀释瓶中，盖紧盖后充分摇匀。,2023/3
19、/4,华南农业大学食品学院王丽,43,4.整粒振摇法,有完整自然保护膜的颖粒状样品(如蒜瓣、青豆等)，直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,44,这是国外使用的一种新型的均质样品的方法，将一定量的样品和稀释液放入无菌均质袋中，开机均质。均质器有一个长方形金属盒，其旁安有金属叶板，可打击塑树袋，金属板由恒速马达带动，作前后移动而撞碎样品。,5.胃蠕动均质法,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,45,（三）冷冻样品的处理,冷冻样品，先将中样在04 下解冻
20、，时间不能超过18h，或在 45 下解冻，时间不能超过15min。再取检样25g做稀释处理。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,46,六、样品的稀释,普通稀释液为浓度0.85的氯化钠溶液、pH6.87.0的无菌蛋白胨水，磷酸缓冲液等，高溶解度的样品可选择蒸馏水。厌氧菌可采用含抗氧剂的稀释液，使用拍击式均质器稀释。嗜渗菌或嗜盐菌，可采用20的蔗糖溶液或15的氯化钠溶液。样品的稀释制备过程应控制在20分钟内完成。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,47,样品的稀释,液体样品：倍比稀释，20min内完成稀释。小颗粒固体样品：均质后倍比稀释，以30cm的幅度摇动25次，20min内
21、完成稀释。粉末或软块样品：拍击式均质30s，脂肪浓度高的样品90s，过程不会引起温度升高，20min内完成稀释。表面样品：倍比稀释，20min内完成稀释。,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,48,样品检验,1.检验前准备2.检验方法确定国内则根据常规国标（细菌总数、大肠菌群等）；国外则根据食品的去向，确定检验指标。例：FDA（美国）、FAO（日本）、WTO（世贸）,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,49,质量控制,对试验用菌株、培养基、试剂等设置阳性对照、阴性对照和空白对照；对重要的检验设备设置仪器对比对实验人员进行技术考核和人员对比；两个以上实验室承担共同微生物检验项目时，应进行实验室间对比,2023/3/4,华南农业大学食品学院王丽,50,七、检验结果处理,检验报告：检验完后，检验人员应及时填写报告单，加盖单位印章，以示生效，立即送出或交食品卫生监督人员处理。样品的保留：一般阳性样品，发出报告后3d(特殊情况可适当延长)始能处理样品；进口食品阳性样品，需保存6个月，方能处理；阴性样品可及时处理；微生物检验不进行复检。,
