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1、1,13.1 细胞工程与育种,植物细胞工程是指以植物细胞全能性为理论基础，以植物组织及细胞培养为技术支持，在细胞水平上对植物进行遗传操作，实现植物改良和利用，或获得植物来源的生物产品的生物技术。植物细胞工程主要包括植物组织与器官培养技术、花药及花粉培养技术、胚胎培养技术、离体受精技术、体细胞突变体筛选技术、原生质体培养与细胞融合技术等。近年来，随着这些技术的发展与完善，及其与常规育种技术的有效集成，在快速繁殖、种质保存、品种选育和遗传改良等许多领域得到广泛运用，显示出了巨大的潜力。,第13章 生物技术在园艺植物育种中的应用,2,13.1.1 花药与花粉培养技术,1）花药培养（1）材料的选取 植
2、物材料的基因型、生长情况及接种时花粉所处的发育时期对花药培养有直接影响。从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育，对多数植物而言，最佳时期是单核中期至晚期。各种植物花药培养的最佳时期是不同的，可根据花药内花粉发育期与花蕾大小、外观形态、色泽的相关性来选取材料。一般采用涂片法来确定花粉发育的时期，用醋酸洋红或卡宝品红或铁钒-苏木精染色后找出小孢子发育的细胞学指标与该种植物花蕾发育形态指标的相关性，便于接种取材。,3,（2）材料预处理与灭菌 在大多数情况下，只有经过预处理的花药才能培养出完整的单倍体植株。预处理的方法有低温、高温、离心和预培养等，目的是要从形态上改变其极性分布，从生理生
3、化上改变其细胞生理状态，以改变其分裂方式和发育途径。经预处理后的花蕾，用乙醇进行表面灭菌后再用次氯酸钠或升汞灭菌后即可接种。,4,（3）接种培养 消毒后的花蕾在无菌条件下，用镊子剥去花瓣，取花药接种于MS、N6、Nitsch等基本培养基上，并将花丝、空瘪及受伤花药剔除。培养温度因不同植物而异，一般在2528之间。,5,2）花粉培养,（1）花药预处理和预培养 预处理方法有黑暗处理、光质处理、高渗处理、药物处理及温度处理等。多采用的是，取花粉处于合适发育期的花蕾，置于410下处理115天。花药预培养也是行之有效的方法，具体是灭菌后的花药置于甘露醇溶液中，漂浮预培养25天，取出花药后再分离花粉培养；
4、也可在无菌条件下取出花药，接种于Nitsch等培养基中预培养数天，然后将花粉分离出来，再进行悬浮培养，小孢子可启动发育。,6,（2）花粉的分离 分离小孢子的方法有挤压法、散落法和器械法三种。无论采用哪种方法，均需得到一定量的小孢子，且无菌、无杂质，成活率高，发育整齐等。所谓挤压法就是用玻璃棒在烧杯壁上挤压花药，使花粉从花药中释放出来。散落法是把花药接种于液体培养基上，悬浮培养17天，花药自然开裂，散出花粉，及时取出花药壁，留下花粉继续培养。器械法是用小型搅拌器或超速旋切机来分离小孢子。,7,（3）培养方法 常用悬滴培养和液体浅层培养。悬滴培养时，每滴可接种5080粒花粉；液体浅层培养用直径5c
5、m的培养皿，加2.5mL花粉悬浮液，花粉密度为每毫升104105个。,8,13.1.2 未受粉胚珠和子房培养,1）未授粉胚珠培养（1）材料的选择 胚囊发育时期是未授粉胚珠培养成败的关键。可根据花的外部形态特征来切取合适发育期的胚囊。此外，在接种前经低温预处理或预培养后也可得到较好的效果，如向日葵将其花序在10预处理一周，可提高诱导率。（2）培养基及培养条件 应用较多的基本培养基有White、Nitsch、MS和N6等。一般情况下，培养基中蔗糖质量浓度为312%，多数为5%。大多数植物胚珠培养温度要求在25左右，但不同植物之间也有所差异。,9,2）未授粉子房培养（1）材料的选择 接种时胚囊所处的
6、发育阶段对子房培养的成败起着关键性作用。有的可根据开花前的天数、未开放花蕾长度来选择子房进行培养，但更多的是根据胚囊发育时期的相关性来选择较准确的培养时期，接近成熟的胚囊较容易诱导成功。（2）培养基及培养条件 常用的基本培养基有MS、N6和BN等，蔗糖质量浓度多为3%10%之间，激素种类及配比因不同材料而异。,10,13.1.3 离体受精,所谓离体受精也称离体授粉，就是把未授粉的胚珠或子房从母体上切离下来，进行无菌培养，并以一定的方式授以无菌的花粉，使之在试管内实现受精。应用这项技术，可使花粉不经柱头和花柱组织而直接进入子房中的胚珠，有可能克服孢子体不亲和，从而得到远缘杂种。此外，这项技术也为
7、外源特异基因的有性转移、诱导遗传转化开辟了广阔的应用前景。1）离体子房受精离体子房受精就是将不同发育阶段的子房连同一段花梗，经消毒后，接种在培养基上，再授以无菌的花粉。花粉可以用不同浓度的硼酸、蔗糖配成花粉悬浮液，在子房上切一个开口，把花粉悬浮液滴入切口中，也可用注射器直接把花粉悬浮液注入子房内，最后将子房接种于培养基上进行培养。此技术是一种接近于自然情况的授粉技术。2）胚珠试管受精 为了提高胚珠培养的成活率，通常选用带有胎座的胚珠进行培养。胚珠包裹在子房内，处于无菌状态，只需子房消毒后直接在无菌条件下把胚珠剥离出来接种于培养基上进行培养。授粉时可以直接把无菌的花粉撒在胚珠上，也可先将花粉撒在
8、培养基上，然后把带有胎座的胚珠接种在散播花粉的培养基上进行授粉。,11,13.1.4 胚培养,杂种胚由于营养或生理的不协调而导致难以播种成苗，或在发育早期就败育或退化，把杂种胚在败育或退化之前直接剥离出来接种于培养基上进行早期离体培养的方式叫做杂种胚挽救。离体胚培养可以克服种间乃至属间受精障碍、打破种子休眠、缩短育种周期、克服种子生活力低下和自然不育等，通过成熟胚和未成熟胚离体培养已获得了不少的园艺植物。,12,1）成熟胚培养,（1）成熟胚培养的意义（2）材料的消毒与接种（3）培养基及培养条件,13,2）原胚培养,（1）原胚培养的概念及意义（2）材料的选择（3）培养基及培养条件,14,13.1
9、.5 胚乳培养,（1）胚乳发育期的选择（2）胚乳愈伤组织的建立（3）培养基与培养条件,15,13.1.6 原生质体培养与融合,1）原生质体分离（1）植物材料的灭菌与处理（2）酶液处理（3）原生质体的收集与纯化 2）原生质体培养（1）液体培养（2）培养方法 固体培养和液体培养均可，应注意原生质体的湿度及培养的温度和光照。3）原生质体融合（1）原生质体融合的概念及意义,16,（2）原生质体融合的方法 常用的方法有聚乙二醇法（PEG法）、电融合法、高pH-高浓度钙离子法和NaNO3等。（3）杂种细胞的选择 杂种细胞选择的方法概括起来有两种，一种是利用物理方法进行选择，另一种是利用杂种细胞的生长特性或
10、突变体互补进行选择。（4）体细胞杂种植株的再生及鉴定 形态学鉴定细胞学鉴定生化鉴定DNA检测鉴定,17,13.1.7 体细胞无性系变异,植物细胞、组织、器官在无菌条件下进行离体人工培养，经过脱分化和再分化的过程，重新形成愈伤组织和完整植株称为体细胞无性系。在培养阶段发生变异，进而导致再生植株也发生遗传改变的现象，称为体细胞无性系变异。无性系变异在园艺植物离体培养中普遍存在，由于很多园艺植物都是无性繁殖的，发现无性系变异后，很快就能通过无性繁殖固定下来，所以无性系变异的研究在园艺植物上更为活跃，在育种上的应用成果相对也较多。（1）突变体的产生,18,（2）突变细胞的筛选方法（3）突变性状的稳定性
11、鉴定,19,13.1.8 植物快繁技术,（1）离体快繁技术体系的建立（2）植物快繁技术的应用,20,13.2 基因工程与育种,植物基因工程是指按照人们的意愿进行严密的设计，经体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造植物种性，使现有物种在较短时间内趋于完善，创造出新种质的过程。它是近30年来随着DNA重组技术、遗传转化技术及离体培养技术的发展而兴起的生物技术。自1983年第一株转基因烟草获得以来，植物基因工程的研究进展迅速。迄今为止，国内外已得到60种以上转基因植物，其中玉米、棉花、马铃薯、烟草和大豆等已大面积种植。,21,13.2.1 基因工程的基本原理与技术,转基因技术大致可划分为两类：一类
12、是载体介导法，即利用另一种生物来实现基因的转入和整合，如农杆菌介导法和病毒介导法等；另一类是DNA直接摄取法，即将裸露的DNA 通过物理或化学的方法直接转入植物细胞，如基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法、花粉管通道法、电击法、显微注射法、超声波导入法等。目前较常用的几种植物转基因技术有农杆菌介导法、基因枪法、聚乙二醇（PEG）介导法及花粉管通道法。,22,1）基因工程的基本要素,（1）外源DNA（2）受体细胞（3）载体分子（4）工具酶 限制性核酸内切酶。DNA聚合酶。连接酶反转录酶。,23,2）植物转基因技术,（1）目的基因的分离与鉴定 鸟枪法。转座子标签法。T-DNA插入突变法基因图谱克隆法
13、。PCR扩增法。,24,（2）重组体DNA分子的构建（3）基因扩增（4）重组体DNA分子导入受体细胞（5）检测和培养（6）转基因植物的大规模种植,25,13.2.2 基因工程在园艺植物遗传育种中的应用,1）创造园艺植物新种质2）改良品质3）提高抗病虫害的能力4）改善抗逆性5）选育抗除草剂品种6）延缓果实成熟7）培育雄性不育系8）改变花卉的花色、花形和花香9）植物生物反应器10）改良其它性状,26,13.2.3 转基因植物的生物安全性及对策,1）转基因植物的环境安全性（1）转基因植物演变为农田杂草的可能性（2）基因漂流到近缘野生种的可能性（3）转基因植物对生物种群的影响 2）转基因植物的食品安全
14、性（1）有毒物质（2）过敏源,27,3）转基因植物生物安全性问题的对策,继续完善转基因技术加强对基因工程生物及其产品的安全性和可能产生的危害进行研究建立完善的检测体系和质量审批制度有关决策层应对转基因产品的产业化和市场化速度进行有序调控通过多渠道、多层次的科普宣传，培养公众对转基因产品及其安全性问题的客观公正意识，从而培养对转基因产品具有一定了解、认识和判断能力的消费群体，并规范转基因产品市场。,28,13.3 分子标记辅助育种,13.3.1 分子标记的概述所谓分子标记有广义和狭义之分，广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质；而狭义分子标记则是指能反映生物个体或种群间基因组中某
15、种差异的特异性DNA片段。分子标记的特点如下：直接以DNA的形式表现，在植物的各个组织、各个发育时期均能检测到，不受环境影响，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，自然存在许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁；许多分子标记能够鉴别纯合基因型和杂合基因型，提供完整的遗传信息。,29,1）分子标记的分类,第一类为基于DNA-DNA杂交的DNA标记，主要包括限制性片段长度多态性（RFLP）标记和可变数量串联重复序列（VNTR）标记。第二类是基于PCR（聚合酶链式反应）的DNA标记。第三类为基于PCR技术与限制性内切酶技术相结合的D
16、NA标记，为两种技术的有机结合，如扩增片段长度多态性（AFLP）标记和酶切扩增多态性序列（CAPS）标记等。第四类为基于单核苷酸多态性的DNA标记，即SNP标记。,30,2）常用分子标记的基本原理及技术,（1）RFLP标记（2）RAPD标记（3）SSR标记（4）ISSR标记（5）SCAR标记（6）SRAP标记（7）AFLP标记（8）SNP标记,31,13.3.2 分子标记数据的处理与分析,1）数据的获得2）统计学处理（1）共有带与特征带（2）相似性系数与距离矩阵 3）表征分析与系统发育分析（1）树状图（2）NTSYS-pc简介,32,13.3.3 分子标记在园艺植物遗传育种中的运用,1）品种鉴别与分类2）遗传多样性检测3）亲缘关系及系谱分析4）分子遗传图谱的构建5）基因定位6）早期预选与聚合育种7）特殊种质的鉴定,33,34,
