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1、神经元形成、干细胞增殖、星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测,导师 XX 教授 研究生 XX,Company Logo,一、课题名称:神经元形成、干细胞增殖、星形胶质细胞和细胞凋亡的在各发育阶段人胚胎脊髓中的检测二、研究目的及意义三、立论依据和国内外研究现状四、实验方法 1、动物和试剂 2、仪器 3、实验详细步骤,Company Logo,五、预期目标六、已具备条件和个人条件七、前期工作基础（可行性）八、研究工作的主要阶段、进度和完成时 间 九、经费预算十、实验风险及前景分析,Company Logo,一 课题名称：NeuN，nestin，GFAP在人胚胎脊髓发育过程中的表达
2、及凋亡细胞的检测二 研究目的及意义：目的：1.检测nestin，GFAP，NeuN在人胚胎脊髓各个发育阶段中的表达及变化；2.不同发育阶段的人胚胎脊髓中凋亡细胞的检测。,Company Logo,意义：检测在人胚胎脊髓中神经干细胞、神经元、星形胶质细胞、凋亡细胞的时空变化规律，探讨其在人胚胎脊髓发育过程中的机制，脊髓发育缺陷的机制，以期为人类胚胎脊髓的发育规律，脊髓损伤后的治疗、修复提供理论依据。,Company Logo,三 立论依据和国内外研究现状1.脊髓损伤严重威胁人们的健康和生活质量，被视为临床治疗的难题。脊髓损伤后的修复一直是神经科学研究领域的一大难题。近年来神经干细胞的发现及其相关
3、研究为脊髓损伤的治疗提供了一种新的策略。,Company Logo,神经干细胞的生物学特性为1(Gage F H,2000)：能分化为神经组织或来源于神经系统；具有自我更新能力；通过非对称分裂产生新的细胞。神经干细胞存在于中枢神经系统的各个发育阶段。在胚胎神经发育过程中，神经干细胞的繁殖发生于神经管相连的中央管表面2(马以骝,2001)。,Company Logo,神经干细胞由胚胎早期的室管膜上皮产生且具有多向分化潜能，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化成逐渐变小的子细胞，最终产生神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞3(Cataudella T,2004)。,Company Logo,
4、神经巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein,Nestin）是Hockfield和Mckay于1985年首先发现的第类中间丝蛋白质，主要在胚胎期神经前体细胞和神经干细胞呈一过性表达。主要定位于细胞质，是未分化状态多能神经干细胞的标志性抗原。,Company Logo,Nestin表达起始于神经板的形成，随着神经干细胞的不断分化，最终成为成熟的神经元和胶质细胞时，巢蛋白分别被神经丝（neurofilament,NF）蛋白和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）等所取代4(Hockfield S,1985)。许多动物实验表明在中枢神经系统的不同发育阶段，神经干细胞与神经元和
5、神经胶质细胞是同时并存的，其比例随着胚龄的增长而发生变5(Conrad A M,2002)。,Company Logo,2.胶质细胞是神经系统中除神经元外的另一类细胞成分。数量上胶质细胞远多于神经元，有报道CNS内胶质细胞与神经元的数目之比为10：150：1。星形胶质细胞约占正常成人中枢神经系统细胞总数的40。星形胶质细胞在中枢的作用不仅仅是保护、营养和支持，还参与血脑屏障的,Company Logo,构成、水的转运、递质的代谢和释放、离子平衡的维持等68(Van Dc Graaff,1998;Sulyokl E,2004;朱长庚.神经解剖学)。胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillar
6、y acidic protein，GFAP）是构成神经胶质细胞的主要细胞骨架蛋白，其表达的高低可以反映胶质细胞的功能状态9(Bigini P,2001)。,Company Logo,活化的星形胶质细胞内GFAP的增高，可能起保护神经元的作用，星形胶质细胞在损伤区分泌多种神经营养因子，以促进中枢神经和周围神经轴索的生长和存活10(JC de la Torre,2002)。,Company Logo,3.在神经系统发育中一个引人注目的现象就是伴随着细胞生长分化的同时也发生大量的细胞死亡。发育中出现的这种由细胞内特定基因程序性表达介导的细胞死亡称为程序性细胞死亡（programmed cell de
7、ath，PCD）。有人估计胚胎时期产生的神经元在向成体发育过程中通过PCD几乎丢失了5080。,Company Logo,很多研究表明PCD存在于神经系统发育的多个环节11(Naruse I,1995)，从未分化的神经上皮到迁移后的有丝分裂后细胞，从神经管的形成12(李泽桂,1999)到神经元与靶区的匹配都有PCD发生，凡不能与靶区正确匹配和参与正常神经网络形成的神经元均通过PCD加以清除13(Homma S,1994)。,Company Logo,四 实验方法4.1 动物和试剂收集从3周到8个月共15个时段的人胚胎脊髓标本81例；所需试剂：封闭用正常羊血清（原液）厂家：北京中杉金桥生物技术有
8、限公司 批号：ZLI-9020,Company Logo,配制方法：封闭用正常血清原液可用PBS或TBS稀释成5-10%（即1：10-1：20倍稀释）后使用。3H2O2 厂家：天津市化学试剂三厂 批号：050905 配制方法：30%H2O2 50ml+蒸馏水450ml,Company Logo,Nestin、NeuN、GFAP抗体 Nestin：Chemicon公司（批号MAB5326)NeuN：Chemicon公司（批号MAB377）GFAP：Upstate公司（批号07650）20 冰箱保存，稀释后4 保存PV9000免疫组化试剂盒 厂家：中杉公司 Lot:50910 2-8保存,Comp
9、any Logo,DAB显色液（ZLI-9032）批号：1386184 2-8保存PBS缓冲液柠檬酸盐修复液TUNELPOD试剂盒 厂家：Roch公司 批号：11684817910,Company Logo,4.2 仪器或设备：(1)高压锅:厂家：潮安县顺发五金制品有限公司 批号：xk16-203-00048(2)显微镜:厂家：Olympus 批号：XS-212-201,Company Logo,(3)LX-100手掌型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂(4)HT-200微量电子天平厂家：成都善瑞逊电子有限公司(5)LX-100手掌型离心机厂家：江苏海门麒麟医用仪器厂,Company Logo
10、,4.3 附助器皿、试剂及常规设备：手术器械，10中性甲醛，系列脱水缸及脱蜡缸，包埋盒，切片架，耐高温切片架，湿盒，4冰箱，20冰箱，37恒温箱，60烤箱，洗瓶，PAP划圈笔。,Company Logo,3.实验详细步骤（1）取材（2）固定（3）制作石蜡切片放入包埋盒中已固定好的组织用自来水冲洗24小时（为了把甲醛除去）；脱水；透明；浸蜡；切片：切成5m厚的切片；贴片：载玻片经过防脱片处理。,Company Logo,Nestin、NeuN、GFAP免疫组化步骤：1.石蜡切片进行常规脱蜡、水化：二甲苯10min 二甲苯10min 无水乙醇10 min 95乙醇5min 90乙醇5min 80乙
11、醇5min 70乙醇5min 蒸馏水3-5min 蒸馏水3-5min。,Company Logo,2.抗原修复：（1）高温高压抗原修复：取适量的柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）于压力锅中（缓冲液的量必须能足够浸没整个切片）放置于电磁炉上加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温染色架上，放入已沸腾的缓冲液中。,Company Logo,盖上锅盖扣上压力阀，继续加热至喷汽，扣阀至喷汽以4-6min为佳。时间到，压力锅离开热源。稍置数分钟后，用自来水冲淋使之冷却，去阀开盖，室温放置20min。自然冷却后取出切片。（2）微波抗原修复 取适量柠檬酸盐缓冲液（PH6.0）于烧杯中放入微波炉里加热至沸腾，将
12、脱蜡,Company Logo,后置于耐高温切片架上的切片放入沸腾的柠檬酸缓冲液中继续加热10min即可，取出烧杯，室温中通风处放置2030min。自然冷却后取出切片。3.用0.01M PBS冲洗2-3min3%H2O2去离子水浸泡10min（以阻断内源性过氧化物酶活性）PBS冲洗3次，每次5min。,Company Logo,4.5羊血清室温下封闭30分钟。5.甩去羊血清，不洗，直接在切片组织上滴加适量稀释的抗体（Nestin、NeuN、GFAP一抗），置于4冰箱过夜。切片置于湿盒中。6.次日上午把切片从冰箱中取出，先在室温中放置30min（以使切片适应室温）。,Company Logo,7
13、.0.01M PBS冲洗3次，每次5min。除去PBS（用力甩去）。每张切片上加一滴试剂 1（中杉公司的免疫组化试剂盒PV-9000），室温下孵育20min。8.0.01M PBS冲洗3次，每次5min。除去PBS。切片上滴加试剂2（PV-9000），室温下孵育30min。,Company Logo,9.0.01M PBS冲洗3次，每次5min。除去PBS。切片上滴加新配制的DAB显色液，不时在显微镜下观察显色情况。切片浸入蒸馏水中以中止显色。10.切片中止显色后，流水冲洗10min。11.脱水、透明。12.中性树胶封固。,Company Logo,细胞凋亡原位检测的步骤：采用TUNEL细胞凋
14、亡检测试剂盒1.石蜡切片常规脱蜡至水。2.新鲜配制3%H2O2，室温处理15min。0.01M PBS液洗涤5min3次。,Company Logo,3.切片上滴加消化液（10mM Tris-Hcl 995ul加入1mg/ml Proteinase K 新鲜稀释至 5ug/ml）,37消化20min，0.01M PBS洗5min3次。4.新鲜配制通透液，4孵育20min或室温孵育8min。0.01M PBS洗5min3次。,Company Logo,通透液：取20 X SSC 20ul，TritionX-100 4ul（45-50预热），加单蒸水3.98ml，定容至100ml，充分均匀。5.标
15、记 甩去切片上多余液体，标本片擦干组织及周边水分，按每张切片滴加1液和 2液（1：9，混合均匀）配成TUNEL反应混和液（冰上操作）。,Company Logo,阴性对照组只加入试剂2液，而不加1液。标本上覆盖塑料盖片，置样品于湿盒中，37标记1h，后4过夜。（20h以上）。0.01M PBS洗5min3次。6.滴加5%牛血清白蛋白封闭液，室温中30min，甩掉封闭液，不洗。,Company Logo,7.转化剂POD 50l/片滴加至标本片上。置样品于湿盒中，37孵育40min.0.01M PBS洗5min3次。8.DAB显色，室温5-10min。单蒸水中止显色，流水冲洗10min。9.脱水
16、，透明，封片。,Company Logo,五 预期目标1.检测不同发育时期的人胚胎脊髓中Nestin、NeuN、GFAP的表达及变化；2.检测不同发育时期的人胚胎脊髓中细胞凋亡的情况；3.探讨脊髓内神经元、神经干细胞、星形胶质细胞与细胞凋亡高峰出现的时间点有何相关性。,Company Logo,六 已具备的条件1.本研究所下属三个实验室：组织化学实验室、细胞室和分子生物学实验室，可开展从形态至分子生物学技术的相关研究。2.导师李力燕教授和王廷华教授多年来从事神经科学的研究，尤其在脊髓发育的研究方面积累了丰富的经验，可提供宝贵的理论和实践指导。,Company Logo,七 前期工作基础（可行性
17、）1.本研究所具有专门的分子室、细胞室、免疫组化室，且各项技术都很成熟；2.已完成了神经营养因子家族与受体（包括NGF、BDNF、NT-3、NT-4、TrkA、TrkB、TrkC）在人胚胎脊髓中的免疫组化染色；3.掌握了免疫组织化学、原位杂交、H-E染色的实验技术。,Company Logo,八 研究工作的主要阶段、进度和完成时间1.实验所需标本已制作完成2.2007.112008.1开始做预实验及正式实验3.2008.12008.4 观察结果，图像分析统计，撰写论文,Company Logo,九 经费预算1.nestin、NeuN、GFAP三个抗体价格Anti-NeuN：3437.50元（c
18、hemicon公司）Anti-nestin：3000元（chemicon公司）Anti-GFAP：3737.50元（Upstate公司）,Company Logo,2.免疫组化试剂盒 第二代通用型二步法检测系统（北京中杉公司，PV-9000）320.00元/3.0ml3.细胞凋亡原位检测试剂盒（TUNEL）Roche公司 4600元4.封闭用正常羊血清（原液）（北京中杉公 司，ZLI9020）45元/10ml,Company Logo,5.其他常规试剂约200元。十 实验风险及前景分析 1.由于实验对象是人胚胎标本，无法及时灌注固定，故有可能导致标本固定不及时不充分，从而使组织结构不完整，损失
19、一部分抗原等；,Company Logo,2.实验结果与预期不符 这就要求我们从标本固定取材开始直至后续的免疫组化染色和原位凋亡细胞的检测都严格操作，不忽视每一个环节、每一个步骤。试剂准备充分，实验设计合理，实验操作熟练、准确，努力将实验风险控制到最小程度。,Company Logo,参考文献1 Gage F H.Mammalian neural stem cells J.Science,2000,287:1433-1438.2 马以骝，杨志敏，王秦秦 等。大鼠胚胎神经干细胞定位及干细胞克隆实验研究。立体定向和功能性神经外科杂志，2001，14（2）：6369.3 Cataudella T,C
20、onti L,Cattaneo E.Neural stem and progenitor cells:choosing the right Shc.Prog Brain Res,2004,146:127-133.4 Hockfield S,Mckay RD.Identification of major cell classes in the developing mammalian nervous system J.J Neurosci.1985.5:3310-3328.,Company Logo,5 Conrad A M,Jean H,Joan W B.Analysis of the te
21、mporal expression of nestin in human fetal brain derived neuronal and glial progenitor cells J.Developmental Brain Research,2002,134(12):87-92.6 Van Dc Graaff,Kent M.Humatn anatomy.United States of America;The McGraw Hill Companies,1998.340-345.7 Sulyokl E,Vajda Z,Doczi T,et al.Aquaporins and the ce
22、ntral nervous system.Acta Neurochir,2004,146(9):955-960.8 朱长庚.神经解剖学.北京:人民卫生出版社，2003.400-407,1033-1046.,Company Logo,9 Bigini P,Bastone A,Mennini T.Glutamate transporters in the spinal cord of the wobbler mouse J.Neuroreport，2001.12(9):1815.10 JC de la Torre.Alzheimers disease:how does it start?J Alz
23、heimers Dis，2002,4（6）:497512.11 Naruse I,Keino H.Apoptosis in developing CNS.Progress in Neurobiology，1995,47(2):13515512 李泽桂，蔡文琴，陈活彝.神经管发生与程序性细胞死亡.解剖科学进展，1999,5(3):22222613 Homma S,Yaginuma H,Oppenheim R W.Programmed cell death during the earliest stages of spinal cord development in the chick embryo:a possible means of early phenotypic selection.J of Comp Neurol,1994,345(3):377395.,Company Logo,Thank You!,
