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1、问题,基因组序列所包含的全部遗传信息是什么？基因组作为一个整体如何行使其功能？用什么方法寻找基因、研究基因的功能呢？,1.寻找基因,1.1 根据开放读码框预测基因A 起始密码子 ATG第一个ATG的确定(依据Kozak规则);Kozak规则是基于已知数据的统计结果.所谓Kozak规则，即第一个ATG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律.,Kozak规则:若将第一个ATG中的碱基A，T，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下：(1)第4位的偏好碱基为G；(2)ATG的5端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基；(4)除-3，-6和-9位，在整个
2、侧翼序列区，C是偏好碱基。,B 信号肽分析 信号肽分析软件(SignalP http:/www.cbs.dtu.dk/services/signalP)把预测过程中证实含完整mRNA 5端的序列翻译为蛋白序列;然后用SignalP软件对前50个氨基酸序列(从第一个ATG对应的甲硫氨酸Met开始)进行评估，如果SignalP分析给出正面结果，则测试序列有可能为信号肽;,C 终止密码子 终止密码子:TAA,TAG,TGA GC%=50%终止密码子每 64 bp出现一次；GC%50%终止密码子每100200 bp 出现一次；由于多数基因 ORF 均多于50个密码子，因此最可能的选择应该是 ORF 不
3、少于100 个密码子。,D 3端的确认 3端的确认主要根据Poly(A)尾序列,若测试DNA片段不含Poly(A)序列，则根据加尾信号序列“AATAAA”和BLAST同源性比较结果共同判断。,E 非编码序列、内含子 高等真核生物多数外显子长度少于100 个密码子，有的不到50个密码子甚至更少；,F 密码子偏爱性 编码同一氨基酸的不同密码子称为同义密码，其差别仅在密码子的第3位碱基不同。不同种属间使用同义密码的频率有很大差异，如人类基因中，丙氨酸（Ale）密码子多为GCA,GCC或GCT,而GCG很少使用。,G 外显子内含子边界 外显子和内含子的边界有一些明显的特征，如:内含子的5端或称供体位（
4、donor site）常见的顺序为 5AGGTTAAGT-3；3端又称受体位（acceptor site),多为5PyPyPyPyPyPyCAG-3(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；,H 上游控制序列 几乎所有基因（或操纵子）上游都有调控序列，它们可与DNA结合蛋白作用，控制基因表达。通过同源性比较来预测mRNA的5端，最常用的与转录起始位点相关的数据库是真核启动子数据库(The TRADAT Project,Eukaryotic Promoter Database,EPD.http:/www.epd.unil.ch/)。另外个别生物基因组的特有组成也可作为判别依据，如脊椎动物基因组许多基因的上
5、游都有CpG岛。,I 软件预测 采用NCBI的ORF预测软件(ORF finder:http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)判断ORF的可能范围。,1.2 同源查询途径 通过已存入数据库中的基因顺序与待查的基因组序列进行比较，从中查找可与之匹配的碱基顺序及其比例，用于界定基因的方法称为同源查询。,同源有如下几种情况：A DNA序列某些片段完全相同；B 开放读码框（ORF）排列类似，如有长外显子；C 开放读码框翻译成氨基酸序列的相似性；D 模拟多肽高级结构相似,1.3 试验分析 Northern 杂交确定DNA片段是表达序列.注意事项：a 当某一基因的
6、转录产物进行可变剪接时，由于连接的外显子不同，会产生好几条长度不一的杂交带;如果该基因是某一基因家族的成员也会出现多个信息；b 考虑组织专一性和发育阶段的问题；,c 基因表达产物丰度的问题 如果风度较低，用拟Northern 杂交和动物杂交（Zoo-blotting）分析。拟Northern 杂交 根据已知的DNA顺序设计引物，从mRNA群体中扩增基因产物，再以DNA为探针与之杂交。,动物园杂交 根据亲缘关系相似的物种，其基因的编码区相似性较高，而非编码区的同源性很低的原理。如果某一物种的DNA 顺序与来自另一亲缘物种的DNA片段杂交产生阳性信号，该区段可能含有1个或多个基因，这种方法又称为动
7、物园杂交。,2 获取基因全长cDNA序列,A 构建cDNA文库，用目的基因DNA片段筛选文库。,cDNA文库构建(CLONTECH),cDNA文库构建,B 根据已知片段设计引物，RACE 技术得到基因的全长cDNA序列。,5RACE(CLONTECH),3RACE(CLONTECH),3.确定DNA序列中基因的位置,A 通过对全长cDNA序列的测序、对比，以及与基因组DNA的比较，确定基因所在的区域；B 通过物种已建立遗传图和物理图来确定基因的位置；,4.实验确认基因功能,4.1 基因剔除(knock-out)最简便的基因失活的方法.主要原理:在一段无关DNA 片段的两侧连接与代换基因两侧相同
8、的序列,将这一构建导入目的细胞,由于同源片段之间的重组,可使无关片段取代靶基因,整合到染色体中.为了便于筛选,用于取代的外源DNA中含有报告基因.,4.2 基因超表达 通过增加基因的拷贝数和采用强启动子促使基因超表达,致使受体表现出生长与发育的异常,来研究基因的功能.,4.3反义RNA,反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA(sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调控基因的表达.,构建反义RNA 表达载体:将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 转化目标生物 获得转基因个体或品系 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 判别目的基因的功能
9、,正义表达载体,反义表达载体,反义RNA 作用机理：A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。,4.4 RNAi干涉,RNAi干涉是通过双链RNA的介导,特异性地降解相应序列的mRNA,从而阻断相应基因表达的转录后水平的基因沉默机制.,RNAi 作用机理,A dsRNA核酸内切酶Dicer被激活,它把dsRNA加工成2125 个核苷酸长的RNA链;B 这些小片段RNA(siRNA)作为另一个核糖核酸复合体RIS
10、C(RNA-induce silencing complex,RNA诱导沉默复合体)的指引物,结合到RISC上,使之识别并降解mRNA,从而导致与双链RNA同源的基因沉默;,RNAi设计方法及应用A Fraser 合成与开放读码框相对应的双链RNA或利用细菌克隆表达这些双链RNA微量注射和喂食干扰同源基因的表达B Chuang 等设计出嵌合体结构 连接强启动子大量表达双链mRNA干扰同源基因的表达,HbF基因的RNAi载体构建,RNAi技术的优缺点,RNAi最根本的特点是特异性RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代;RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因,RNAi也会同时作用与它们.,4.5 酵母双杂交（yeast two-hybridization）,原理：其原理涉及转录因子与启动子之间的互作。正常条件下：转录因子（包括两个功能区域）结合功能域同基因上游的区段结合 激活功能域激活RNA多聚酶 将基因转录为mRNA,酵母杂交系统中：融合表达载体1 融合表达载体2,DNA结合功能域+目的片段,激活功能域+多种未知cDNA,融合表达载体1同一细胞 融合表达载体2,形成聚合物，启动报告基因的表达,表达载体共转化,
