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1、实验二线粒体和液泡系的超活体染色与观察,一、实验目的,1 观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、发育和分布；2 了解细胞和细胞器的超活体染色的原理和相关技术。,线粒体和液泡系,线粒体是细胞内一种重要细胞器，主要功能是进行氧化磷酸化，合成ATP，为细胞生命活动提供直接能量，是细胞进行呼吸作用的场所。此外与细胞中氧自由基的生成、细胞凋亡、细胞信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控有关。线粒体的形态、大小、数量、分布在不同细胞中和细胞的不同生理状况下变化很大，具有多形性、易变性、运动性和适应性等特点。（1）形态：线状和颗粒状最常见，也可呈哑铃状、环状与枝状；,（2）大小：一般直径
2、为0.5-1.0m，长1.5-3.0m，线粒体的形状、大小随着细胞代谢条件的不同而改变；（3）数量：一般动物细胞中线粒体有几百到几千个不等，植物细胞的线粒体数量少于动物细胞的线粒体，而许多哺乳动物成熟的红细胞缺少线粒体，新陈代谢旺盛的细胞中线粒体多；（4）分布：分布不均匀，要满足细胞的能量供应需要，代谢旺盛的部位线粒体比较集中。,液泡系是细胞内一种重要的细胞器，它普遍存在于植物细胞，通常为圆形泡状，数目多少不定，液泡是细胞内浓缩产品的重要场所，有十分重要的生理功能：1、强维持细胞的紧张度是它所起的明显作用，2、贮藏各种物质，3、含有水解酶，它可以吞噬消化细胞内破坏的成分，4、液泡在植物细胞的自
3、溶中也起到一定作用。动物细胞内的液泡因为很小，如不经活体染色，很难显示出来。,二、实验原理,活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。,二、实验原理,根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，活体染色可分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定于细胞内某些特殊结构内以达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活体染色，是由活的动植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液
4、浸染，染料因其”电化学”特性与被染部分相互吸引被选择固定在活细胞的某种结构中而显色。,二、实验原理,但不是任何染料都可作为活体染色剂使用，一般应选择那些无毒或毒性小的碱性染料(易溶于类脂质)并配成较稀的溶液来使用。詹纳斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色中重要的染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性。詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行活体染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基。,二、实验原理,中性红染色液泡的原理：在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一
5、般情况下呈酸性反应，因此进入液泡的中性红便解离出大量阳离子呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色，死细胞由于原生质变形凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。中性红对液泡系的染色具有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核和细胞质不着色，这可能与液泡中的某些蛋白质有关。,三、实验用品,1 器材：显微镜、剪刀、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸管、解剖针、吸水纸2 试剂：Ringer液、1/5000詹纳斯绿、1/3000中性红3 材料：家兔肝脏、洋葱、绿豆幼根根尖,四、实验方法,（一）线粒体的超活染色与观察1.家兔肝细胞线粒体的超活体染色与观察（1）取
6、样 用割断颈动脉的方法处死家兔，置于解剖盘中，迅速打开腹部，取出边缘较薄的肝组织，放入盛有Ringer溶液的培养皿中，洗去肝组织中的血液，一般要洗3-4次才能将绝大部分血液洗去。（2）染色 另取一个干净的培养皿，将洗净的肝组织移入，向肝组织上滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，但不可将组织块完全浸没，要让组织上面部分半裸露在空气中，这样肝细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。一般需要染色30 min当组织块边缘被染成蓝绿色即可。,四、实验方法,（3）分离细胞 染色后，用两根解剖针同时左右手操作，将两根针压住组织块，然后用右手稍稍用力拉开组织块，这样就会有一些细胞或细胞群和组织块分离开。（4）
7、制片观察 用吸管吸分离的细胞，滴一滴在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察。在高倍镜或油镜下观察，可见肝细胞中的线粒体染成蓝绿色，呈颗粒状或线条状，在细胞核周围分布特别多。,四、实验方法,（一）线粒体的超活染色与观察2 洋葱鳞茎内表皮细胞线粒体的超活染色与观察。用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B溶液1滴滴在干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮平铺在染液中，染色1015min，吸去染液，加Ringer溶液1滴，盖上盖玻片，显微镜下观察。颗粒状的线粒体被染成蓝绿色。,四、实验方法,（二）绿豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察 用刀片把初生的绿豆幼苗根尖（12cm）小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红溶液中，染色510min，吸去染液，加Ringer溶液1滴，盖上盖玻片压扁根尖，显微镜下观察。在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散着很大大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的小液泡，然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少，在成熟区一般只有一个淡红色的大液泡，占住细胞的绝大部分，将细胞核挤到壁处。,五、作业,1 绘出家兔肝细胞和洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的形态与分布并简要分析。2 绘出绿豆幼根根尖组织液泡系的形态与分布并简要分析。,下次实验：细胞主要化学成分的检测,
