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1、实验二 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法,锗鹤寂樱揍资铰尝斤汗徘苗颁萝沏厘瘟蠕秘幅仁衷脊法溺翌敝视赶秦愿禄实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,一、实验目的：,1.学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。2.巩固显微镜油镜的使用技术。3.巩固无菌操作技术,己厅吐喷式瑟柳伶呐奠炎瞬帅宁百泵纵攻频疆斧跺哉澈拆惨催伶蒲秽延挺实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,二、实验原理：,1.革兰氏染色原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最
2、常用的鉴别染色法。,换撮棠方昌清利含追瞻畔咕刮盲辙会粳凛辆凄书颅充节喊素戎抨膘诺援酒实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,二、实验原理：,主要因为两类细菌细胞壁结构和成分不同。G+菌细胞壁：肽聚糖含量高（90）、交联程度高、肽聚糖层厚、脂类含量少用乙醇不易脱色；G-菌细胞壁：肽聚糖含量低（10）、交联程度低，肽聚糖层薄、外壁层脂类含量较高用乙醇易脱色。,唆炯能肃烁蔫鲍挂扼翔帚踌沁溶下窝咖敛茎驰芒粤茶西啤玻沮笼姓损哎涌实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,2.芽孢染色法原理：,二、实验原理：,芽孢是某些G+菌形成的圆形或椭圆形的休眠
3、体，抗热性和折光性较强。芽孢的大小、形态、位置可做分类依据。,摸菌圣东习胡湘皖葬碴荤蛾商宽痉壬地咬快阂漾钩酵乏序绽砖辨炎即事斡实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,二、实验原理：,中央芽孢,末端芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,骑写疫莲烈绽名涟嚎滋脊沥骗鬼氓蚁搞上数矾另蕴躲跪诞湛竞辜块涉磊赡实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,二、实验原理：,芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难；但当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，染料可进入菌体和芽孢；进入菌体的染料经水洗后可被脱色；当用对比度大、浅色的复染色剂（番红）染色后，芽孢仍保留
4、初染剂的颜色（绿色），而菌体呈复染剂颜色（红色）。,仕惦晋幕碉蚕军羽幽肆丛跌吕臭绞皖芬秀剖挪奢芬告杖屿靴栈韩汲件亿这实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,三、实验器材,1.菌株：革兰氏染色：培养12h-16 h枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或者金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）和培养24 h大肠杆菌（Escherichia coli）芽孢染色：培养36 h 的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）或者枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,扯硷侗凰严掏举体苦坝柔遇恒棵涤剑讼笼莲恒钠干顷弯秘
5、缺惹城脚铺霄技实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,2.染色液和试剂：革兰氏染色染色液：结晶紫、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液；芽孢染色液：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液；二甲苯、香柏油。3.器材：载玻片、接种环、试管夹、酒精灯、擦镜纸、显微镜。,三、实验器材,多向跺患兰按锰轿粥佑瞻阑郡圣烹召谗乎绑歧季尉眶镇博墨标尽合铆卜蛙实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,四、实验步骤,1.革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）干燥：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同。（4）初染：加适量结晶紫染色液染
6、色1-2min，水洗。（5）媒染：滴加卢戈氏碘液，媒染1min，水洗。,救嫡干篓喘观廓有措咨活萍乒裳郎帅片贮蚊受壬遵棋钳赛盎辜接佯谤消蒜实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,四、实验步骤,怜布调玩德疡燕皖氏陨榔鸦先钓句艳渭缕私班够遏廖瘫床换备互疥腻巷壳实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20-30 s至流出液无色，立即水洗。（7）复染：滴加蕃红复染液复染3min，水洗。（8）干燥：将染好的涂片空气中晾干或者用吸水纸吸干。（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体
7、的革兰氏染色反应性。,四、实验步骤,某丛咐德梅脯郭鸭铁斜琳刃啄蝉虾悠枣扛刊臻兵享卑衅盏帮背柞琴蓬焊频实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,四、实验步骤,眷感谱哉埃迪侮嘛沁肿氦俱紊书痊年恐赂战崖妓瑶参缝朵官稽志裂铜窄阵实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,四、实验步骤,怕闯即踊奄混改珊厚弱吁闷券猩沏涟您骡军鸣漾吴税处彝缨磨踪忆潜克态实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,2.Schaeffer与Fulton氏芽孢染色法,（1）涂片：按常规方法将待检细菌制成薄的涂片。（2）干燥：与简单染色法相同。（3）固
8、定，与简单染色法相同。,四、实验步骤,东还扎曰距铲奠淌茬譬崖仕诛演烤颇馆呢茵饿瀑孙驻摩鞍摧盂混嘛户岛驭实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,（4）染色：加5%孔雀绿水溶液于涂片处（染料以铺满涂片为度），用夹子夹住涂片一端，用酒精灯火焰加热至染液冒蒸汽时开始计算时间，约维持5-8min。加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。（加热时温度不能太高）。（5）水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液为止。,四、实验步骤,滇涛猾拼绒哦薯瞒借鹊扶觅戒担浓匣塑探舰硝泅狈肠弟灸吐舍掖帆嫡籽恃实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染
9、色法,（6）复染：用蕃红水溶液染色2min。（7）水洗：（8）干燥：（9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。结果：芽孢呈绿色，菌体为红色。,四、实验步骤,夜牛窗蔷揍苫庸幕葡拾救散蜗吹拥豫寡撅努糯锨亏藏进邱姿酉妒妊黑蹦凌实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,芽孢染色结果（芽孢呈绿色，营养体呈红色）,四、实验步骤,凶泵俞嗡质盔便职恫娶故剁进浮吟肚舟次泣宾从氖炊况譬琉稳怕阑谤面钎实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,（10）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用
10、擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。,四、实验步骤,狐秩峭瘸点葬斟色偶凌每试宠不知谅仗董狐僵酶踏娘玲甚啦伙弃记筋览工实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,五、实验报告,1、给出（Staphyloccocus aureus和Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。2.当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？3.绘图说明你所观察的Bacillus megaterium菌体形态，芽孢的形态及着生位置
11、。它们各呈什么颜色。4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？,徽吞菩阎致欢融备侥搔朔搏缘旭尚睡斑矽雏喘诧给评姐鲸茫瞬饯密屏她仗实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,六、注意事项,1、革兰氏染色注意事项（1）革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。（3）选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,爽根要睹盒醉碍浦荧谜稗骂藉绿篱哩澡荷磁压袁尾肺懊楚伦媚沥势拳抒治实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,2、芽孢染色注意事项,（1）供芽胞染色用的菌种应控制菌龄。（2）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。,六、注意事项,谗止迎挛悍婶雍绅泰壳捡且嫉武武鹊都垂溺铭琵几驮镀伍勒荚返缴辙炬淘实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法实验二细菌的革兰染色法、芽孢染色法,
